六味地黄汤对糖皮质激素肾阴虚模型免疫器官淋巴细胞凋亡的抑制作用(Ⅱ)

1、    六味地黄汤对糖皮质激素肾阴虚模型免疫器官 淋巴细胞凋亡的抑制作用()          摘要：为进一步探讨肾阴虚证在免疫学上的实质，随机将 30 只 NIH 小鼠分为正常对照组、模型对照组和六味地黄汤组，给药 6 d 后处死动物，以原位末端标记法检测脾动脉周围淋巴鞘区域的 T 淋巴细胞凋亡情况。结果显示，正常对照组动脉周围淋巴鞘少有 T 淋巴细胞凋亡，模型组动脉周围淋巴鞘见较多 T 淋巴细胞凋亡，而六味地黄汤组动脉周围淋巴鞘 T 淋巴细胞凋亡数明显

2、低于模型组(P0.05)。提示滋阴补肾中药六味地黄汤有拮抗糖皮质激素诱导脾 T 淋巴细胞凋亡的作用。反证了肾阴虚证存在脾 T 淋巴细胞凋亡的情况，而滋补肾阴药物对其有抑制作用。主题词：肾阴虚/免疫学；六味地黄汤/药理学；脾/病理学；T 淋巴细胞/药物作用；脱噬作用/药物作用中分类号：R318.15；R285.5文献标识码：A文章编号：1007-3213(2000)03-0207-02Inhibitory Effect of Liuwei Dihuang Decoction on Lymphocyte Apoptosis in Immune Organ of Glucocorticoid-ind

3、ucedKidney-yin-deficiency Animal Model()XU Qin，DU Biaoyan，LUO Hui，SU Junfang，WU Shaofeng（Dept. of Pathology, Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405, China）Abstract: To further explore the immunological mechanism of kidney-yin-deficiency syndrome, NIH mice were allocated to three groups: norma

4、l control group, model group and Liuwei Dihuang Decoction (LDD) group. Apoptotic T lymphocyte in lymphatic sheath around splenic artery was detected with in situ end labeling technique after medication for 6 days. The results showed that the number of apoptotic T lymphocytes was more in the model gr

5、oup than that in the normal group, and much less in LDD group than that in the model group (P0.05). This indicates that LDD with the action of nourishing Yin and tonifying kidney can antagonize T lymphocyte apoptosis induced by glucocorticoid.Key words: KIDNEY-YIN DEFICIENCY/immunol.;LIUWEI DIHUANG

6、DECOCTION/pharmacol.;SPLEEN/pathology;T-LYMPHOCYTES/drug eff.;APOPTOSIS/drug eff.六味地黄汤是滋阴补肾的经典古方，以往的实验证明，六味地黄汤对糖皮质激素诱导的 NIH小鼠胸腺萎缩有拮抗作用1。细胞免疫缺陷现象既发生在婴幼儿和青少年，也可发生在成年人，而青春期后胸腺逐渐萎缩，细胞免疫功能由周围免疫器官行使。为了解六味地黄汤对周围免疫器官细胞免疫功能的影响，并进一步探讨肾阴虚证的实质，我们在相同动物模型的基础上，对脾淋巴细胞凋亡进行了检测、分析。1材料与方法1.1动物NIH小鼠，雄性，体重1822g，由广东省实验动物所

7、提供。1.2药物氢化可的松注射液(扬州制药厂)，20mL/支，批号：980403。六味地黄汤由熟地黄24g、山茱萸12g、淮山药12g、泽泻9g、茯苓9g、牡丹皮9g组成。药材由本校第一附属医院中药房提供，经本校中药鉴定教研室鉴定。将上述中药材置陶器内加水1L浸泡1h后煎煮1h，将再次药液混合浓缩至75mL(每mL含生药1g)，用双层纱布过滤后置4冰箱保存备用。1.3分组及给药将小鼠分为3组，每组10只。正常对照组：每天肌注生理盐水0.04mL，灌胃饮用水0.5mL，共6d。模型对照组：每天肌注氢化可的松0.04mL(5g/L)，灌胃饮用水0.5mL，共6d，造成肾阴虚模型。六味地黄汤组：同模

8、型组造模，并每天灌六味地黄汤0.5mL(1kg/L)，共6d。1.4病理检察给药结束后处死小鼠，完整取下脾脏，10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，5m切片，常规HE染色，生物显微镜下观察。1.5脾组织细胞凋亡检测采用原位末端核苷标记法(TUNEL)检测凋亡细胞。原位细胞凋亡检测试剂盒由德国宝灵曼公司提供。步骤如下：(1)5m切片；(2)二甲苯，10min；(3)二甲苯，10min；(4)95%酒精，10min；(5)95%酒精，10min；(6)80%酒精，10min；(7)双蒸水稍洗；(8)PBS洗5min×2次；(9)0.01mol/LSSC微波，10min；(10)3%H2O2，

9、37，10min；(11)PBS洗5min×3次；(12)末端核苷酸转移酶50L加入550L荧光素标记的核苷酸混合液，37，2h；(13)PBS洗5min×3次；(14)过氧辣根酶标记的羊抗荧光素抗体，37，30min；(15)PBS洗5min×3次；(16)DAB显色10min；(17)苏木素复染；(18)返兰，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。OlympusBX40生物显微镜下观察。    1各组脾动脉周围淋巴鞘T淋巴细胞凋亡状况a.正常组；b.模型组；c.六味地黄汤组2结果2.1一般形态观察各组脾脏红髓、脾小体均

10、见细胞凋亡，并见散在多核巨细胞凋亡，考虑可能为巨噬细胞。但在动脉周围淋巴鞘区域(T淋巴细胞集聚区)，正常组细胞凋亡较少见，模型组见较多淋巴细胞凋亡。结果见封底本文1。2.2动脉周围淋巴鞘凋亡细胞计数在动脉周围淋巴鞘附近切片每张片随机取2个高倍视野，计算凋亡细胞数，结果见表1。组别N/只N凋亡细胞/(个.视野-1)正常对照组99.44±4.54模型对照组1087.61±76.61*六味地黄汤组833.43±14.66     统计方法：t检验；*与正常组比较P0.001；与模型组比较P0.05 3讨论六味地黄丸(汤)是经典的滋

11、阴补肾古方，出自小儿药证直诀，由熟地、山茱萸、淮山药、泽泻、茯苓、牡丹皮6味中药组成3。现代研究表明，肾阴虚证多伴有肾上腺皮质功能亢进和糖皮质激素水平升高，故以过量的糖皮质激素制备肾阴虚动物模型是目前医学界比较公认的方法2。这种糖皮质激素水平的升高必然影响机体的免疫功能。在青春期之前，糖皮质激素水平的升高既可以影响中枢免疫器官胸腺，又可影响周围免疫器官。青春期以后，由于胸腺逐渐萎缩，这种糖皮质激素水平的升高，应主要影响周围免疫器官。有实验显示，糖皮质激素水平的升高可引起胸腺的萎缩，其机制为糖皮质激素诱导了胸腺细胞的凋亡4，5。而本实验的结果进一步显示，六味地黄汤(丸)可拮抗糖皮质激素诱导的脾动

12、脉周围淋巴鞘区域T淋巴细胞的凋亡。同时本实验结果也可能提示，对于成人继发性T细胞免疫缺陷症，以六味地黄汤(丸)为主进行滋阴补肾治疗，有一定的临床应用前景。基金项目：广东省中医药管理局课题(NO.97072)作者简介：徐勤(1963-)，男，讲师徐勤（广州中医药大学病理教研室，广州510405）杜标炎（广州中医药大学病理教研室，广州510405）罗惠（广州中医药大学病理教研室，广州510405）苏俊芳（广州中医药大学病理教研室，广州510405）吴绍锋（广州中医药大学病理教研室，广州510405）参考文献：1杜标炎，徐勤，罗惠，等.六味地黄汤抗糖皮质激素所致小鼠胸腺萎缩的病理学研究J.广州中医药大学学报，1999，16(2)：1112陈小野.脾虚和肾虚动物模型的研究思路J.中国医药学报，1988，3(1)：643许济群，王绵之，许子建，等.方剂学M.上海：上海科技出版社，1993.1044马春树，姜叙诚，