体外培养的小鼠胚胎成纤维细胞分泌松果体素的研究

1、体外培养的小鼠胚胎成纤维细胞分泌松果体素的研究体外培养的小鼠胚胎成纤维细胞分泌松果体素的研究#刘雅静1，孟凡涛1，吴蕾2，周江宁1*基金项目：本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金（项目编号：20093402120028）的资助。作者简介：刘雅静，（1978-），女，讲师，主要研究方向为老年性痴呆的发病机制。通信联系人：周江宁，（1956-），男，教授，主要研究方向为老年性痴呆与抑郁症的发病机制。E-mail:钟1, 2，抗氧化的保护作用3, 4，改善学习记忆5, 6和免疫调节功能7, 8。一般而言，从色氨酸合成松果体素需要一系列的酶促反应。首先，色氨酸从血液循环中被摄取，经过羟化，脱羧，N

2、-乙酰化和氧甲基化，最终形成松果体素。其具体过程如下：色氨酸在色氨酸羟化酶（Tryptophan Hydroxylase, TPH）的作用下羟化为5-羟色氨酸(5-Hydroxytryptophan)。5-羟色氨酸经过芳香氨基酸脱羧酶（Aromatic Amino A 50 cid Decarboxylase）的作用转化为5-羟色胺（5-HT）9。TPH 是5-HT 合成通路上的限速酶，它有两种亚型，即TPH1 and TPH2 10。5-HT 是一个多代谢途径的产物，一方面，5-羟色胺在N- 乙酰基转移酶（serotoninN-acetyltransferase, NAT）的作用下经过N-乙

3、酰化形成N-乙酰基-5-羟色胺（NAS）。最后通过氧甲基化将N- 乙酰基-5- 羟色胺（ NAS ） 在羟基吲哚甲基化转移酶55 （hydroxyindole-O-methyltransferase，HIOMT）的作用下迅速转化为松果体素。合成以后的松果体素并不储存在松果体，而是随即被动地进入血液循环11。另一方面，在松果体素的代谢旁路上，5-HT 也可以被单胺氧化酶A（monoamine oxidase A，MAOA)氧化成5 - 羟吲哚乙酸（5-HIAA）11。实际上，单胺氧化酶有两个亚型，即单胺氧化酶A（MAOA）和单胺氧化酶B（MAOB）. MAOA 在5-HT 的代谢过程中起着很重要

4、的作用12。60 据报道，循环中的松果体素水平主要来源于松果体，然而，一段时间以来，其他部位来源的松果体素也相继被发现。这些其他可以产生松果体素的部位主要包括视网膜13，卵巢14, 15，睾丸16，哈德氏腺17，胃肠道18，皮肤19等，另外，骨髓干细胞20, 21，淋巴细胞22，血小板23，甚至胆汁中24也有很高的松果体素。我们在研究中发现，体外培养的大鼠原代星形胶质细胞和星形胶质瘤细胞系C6 可以合成和分泌一定量的松果体素25,65 并且，ApoE 不同的基因型通过影响松果体素合成通路上的关键酶NAT 和代谢旁路上的关键酶MAOA 从而对星形胶质细胞来源的松果体素有不同的调节作用26，但其具

5、体的分子机制还不十分清楚。Jimenez-Jorge 等报道，在发育的不同阶段去除松果体后的大鼠脑中也有松果体素的存在27。他们的研究结果在一定程度上支持了我们的发现：大脑中松果体素可能不局限在松果体内；皮层星形胶质细胞也可以合成和分泌一定量的松果体素，具体的生理70 功能将成为未来研究的主题。并且，据报道，松果体素的受体在视网膜28, 29，卵巢30，淋巴细胞31，皮肤19，血小板32和星形胶质细胞33中都有表达。松果体素受体的广泛表达暗示了松果体素在这些组织和细胞的局部保护作用34。虽然松果体素在许多细胞上都有表达，但我们并不知道其在小鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3）中是否表达。在这篇文章

6、中，我们主要研究小鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3）培75 养上清中是否有松果体素的存在以及5-HT合成通路上的关键酶TPH和松果体素合成通路上的关键酶NAT 在小鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3）中的表达。1 材料与方法1.1 动物和试剂小鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3） 购于ATCC。 细胞培养基Dubuccos modified Eagles80 medium (DMEM) 和 胎牛血清（fetal bovine serum, FBS) 购于Gibco 生物公司。 缓冲液HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid), 谷

7、氨酰胺（L-glutamine）, 青霉素（penicillin）, 链霉素（streptomycin）, 兔抗5羟色胺（rabbit anti-serotonin）, 胶原酶（collagenase）, 维生素C（Ascorbic acid）购于Sigma-Aldrich 公司。 Melatonin ResearchRIA kit 购于 Labor Diagnostika Nord (LDN, Germany) 公司。单克隆鼠抗-tubulin（Monoclonal mouse anti-tubulin）和异硫氰85 酸荧光素标记的羊抗兔IgG （FITC-goatanti-rabbit I

8、gG） 购于 Santa Cruze 生物公司。RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis kit 购自 MBI 公司。The Taq-DNA-polymerase 购于Takara 生物公司. HRP conjugated goat anti-rabbitIgG 购于Promega 公司。Melatonin Research RIA kit 购于 Labor Diagnostika Nord (LDN,Germany)公司。90 1.2 细胞培养小鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3）体外培养在含10%胎牛血清, 55 g/ml 丙酮酸钠, 2mM谷氨酰胺（L-

9、glutamine）,25mM HEPES, 4 mg/ml 葡萄糖, 100 units/ml 青霉素，0.1 mg/L 链霉素的DMEM 培养基中，并按细胞密度约3.0105 个细胞/ml 接种在100mm 的培养皿中，在37，5CO2 条件下培养35。95 1.3 免疫荧光染色免疫荧光染色参考文献提供的步骤进行36. 小鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3）用4%甲醛固定，后用TBS 缓冲液 (Tris Buffered Saline: 0.05M Tris, 0.9% NaCl, pH 7.6) 溶液洗3 次，每次10 分钟，1triton/0.3%H2O2/TBS 避光温育30 分钟，5羊

10、血清（ goat serum）37封闭60 分钟，I 抗（rabbit anti-serotonin,1:800,用5羊血清配制）先37温育60100 分钟，后4过夜。最后用80%甘油封片，激光共聚焦显微镜拍照36。1.4 实时定量 PCR实时定量PCR 按照SYBR Green PCR 试剂盒提供的方法以终体积 30l 进行反应。用于PCR 反应的小鼠NAT, TPH1, TPH2, MAOA 和-actin 引物序列见表1.反应条件如下:95C 5 分钟; 95C 30 秒，40 个循环；60C 1 分钟。实验仪器使用ABI Prism 7000 PCR 仪。105表1. 实时定量 PCR

11、 反应中所用的小鼠引物Gene Forward ReverseNAT GTCGACTCCTATGAAACAGTCGT ATCTAAAGTCCTACAGTTCGGGATPH1 CACGAGTGCAAGCCAAGGTTT AGTTTCCAGCCCCGACATCAGTPH2 GAGTTGCTCCACGCTTTGC ACACTCAGTCTACATCCATCCCMAOA CGGATATTCTCAGTCACCAATG ATTTGGCCAGAGCCACCTA-actin GCCGATCCACACGGAGTACTT TTGCCGACAGGATGCAGAA1.5 收集细胞培养上清当细胞密度达到106 时，收集小

12、鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3）培养上清以备检测松果110 体素用。收集细胞培养上清时注意避光，并且，收集细胞培养上清的时间不超过3 分钟。随后，收集的细胞培养上清在412000rpm 离心10 分钟。最后，尽快将细胞培养上清放于80避光保存，以备检测用。1.6 松果体素放射免疫分析（RIA）小鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3）培养上清中的松果体素水平用放射免疫分析（RIA）115 法检测，检测步骤按照公司推荐的进行。检测试剂盒中标准品的松果体素水平的检测范围为0pg/ml-1000 pg/ml。松果体素检测的标准曲线高度相关，相关系数为0 .999。为了减少误差，每个样本均检测两次。松果体素与

13、N已酰5羟色胺及5羟色胺的交叉反应分别为0.8%和0.01%。松果体素检测试剂盒的灵敏度是0.8 pg/ml。1.7 统计分析120 相关实验数据用t-test 进行统计分析。预期值用平均值标准误来表示。当p0.05 时被认为具有显著性差别。2 结果在这篇文章中，我们收集了体外培养的小鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3）培养上清，并用放射免疫方法（RIA）检测了NIH3T3 细胞培养上清中的松果体素水平。放射免疫分析实125 验结果表明，体外培养的NIH3T3 细胞培养上清中具有一定量的松果体素，它的水平是67.554.49pg/ml (图1)。另外，在空的加有胎牛血清的完全培养基中也发现有极少量

14、的松果体素水平（6.510.9 pg/ml）。松果体素的合成需要它的前体物质5羟色胺和它的关键酶N-乙酰基转移酶（serotoninN-acetyltransferase, NAT），而5羟色胺的合成需要色氨酸羟化酶（TPH），这样，我们检130 测了TPH、5羟色胺和N-乙酰基转移酶在培养的NIH3T3 细胞中的表达。QPCR 结果表明，NIH3T3 细胞中有色氨酸羟化酶TPH1 和TPH2(图2）和N-乙酰基转移酶（NAT）mRNA(图3)的表达。免疫荧光染色结果显示，在NIH3T3 细胞中有很多5羟色胺免疫阳性细胞(图4)。图1 小鼠胚胎成纤维细胞培养上清中的松果体素水平135 Fig1

15、 Melatonin in the supernatant of cultured NIH3T3 cells图2 小鼠胚胎成纤维细胞TPH1 和 TPH2 的表达Fig2 TPH1 and TPH2 mRNA in NIH3T3 cells.140 图3 小鼠胚胎成纤维细胞NAT 的表达Fig3 NAT mRNA in NIH3T3 cells图4 小鼠胚胎成纤维细胞中5-HT 的表达145 Fig4 Serotonin in the cultured NIH3T3 cells3 结论在这篇文章中，我们首次发现体外培养的小鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3）可以合成少量的松果体素（melatonin）。5羟色胺是松果体素合成的前体物质，色氨酸羟化酶（TPH）150 是5羟色胺合成的关键酶，而N-乙酰基转移酶（NAT）是松果体素合成的关键酶。我们的免疫荧光染色结果表明，小鼠胚胎成