六味地黄汤对糖皮质激素肾阴虚模型免疫器官淋巴细胞凋亡的抑制作用(I)

1、    六味地黄汤对糖皮质激素肾阴虚模型免疫器官 淋巴细胞凋亡的抑制作用(I)          摘要：为进一步探讨肾阴虚证在免疫学上的实质，将30只Wister大鼠分为正常对照组、模型组、六味地黄汤组3组，采用糖皮质激素肾阴虚大鼠模型以原位末端标记法标记凋亡细胞，观测了六味地黄汤对胸腺淋巴细胞凋亡的影响。结果显示：模型组淋巴细胞凋亡增多，且多在胸腺皮质部，凋亡细胞计数模型组显著高于正常对照组(P0.01)；六味地黄汤组淋巴细胞凋亡较模型组明显减少，凋亡细

2、胞计数六味地黄汤组低于模型组(P0.01)。提示六味地黄汤能够抑制糖皮质激素诱导的胸腺淋巴细胞凋亡。反证了肾阴虚证存在胸腺淋巴细胞凋亡的情况，而滋补肾阴的药物可以对其有抑制作用。主题词：肾阴虚/免疫学；六味地黄汤/药理学；淋巴细胞/药物作用；脱噬作用/药物作用；胸腺/药物作用中分类号：R318.15文献标识码：A文章编号：1007-3213(2000)03-0204-03Inhibitory Effect of Liuwei Dihuang Decoction on Lymphocyte Apoptosis in Immune Organ of Glucocorticoid-induced K

3、idney-yin-deficiency Animal Model()DU Biaoyan，XU Qin，WU Shaofeng，LUO Hui，SU Junfang，ZHONG Tingji （Dept. of Pathology, Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405, China）Abstract: To further explore the immunological mechanism of kidney-yin-deficiency syndrome, Wistar rats were allocated to three g

4、roups: normal control group, model group and Liuwei Dihuang Decoction (LDD) group. The kidney-yin-deficiency rat model was induced by glucocorticoid and thymocyte apoptosis was measured with in situ end labeling technique. The results showed that lymphocyte apoptosis was obvious in the model group a

5、nd mainly in thymic cortex. The number of apoptotic lymphocytes was increased in the model group as compared with that in the normal control group (P0.01) and was decreased in LDD group as compared with the model group (P0.01). It is indicated that lymphocyte apoptosis exists in the thymus gland of

6、kidney-yin-deficiency rat model, and LDD with the action of nourishing kidney-yin can inhibit glucocorticoid-induced lymphocyte apoptosis in the thymus gland.Key words: KIDNEY-YIN DEFICIENCY/immunol.;LIUWEI DIHUANG DECOCTION/pharmacol.;LYMPHOCYTES/drug eff.;APOPTOSIS/ drug eff.;THYMUS GLAND/ drug ef

7、f在既往“肾与免疫关系”的研究中发现，糖皮质激素肾阴虚模型的胸腺出现萎缩，而滋阴 补肾中药对造型过程中引起的胸腺萎缩有拮抗作用1，2，并且大量的研究证明，糖皮质激素能诱导淋巴细胞凋亡3，4。糖皮质激素增多可诱导免疫器官内的淋巴细胞凋亡，细胞数目减少，体积缩小，重量减轻，免疫器官出现萎缩。为进一步探讨肾阴虚证的免疫学实质，我们观察了六味地黄汤对糖皮质激素肾阴虚动物模型胸腺细胞凋亡的抑制作用。现将结果报告如下。1材料与方法1.1动物Wister大鼠，体重5070g，健康、雌雄各半，由广州中医药大学实验动物中心提供。1.2试剂及药物细胞凋亡检测试剂盒(in situ cell death detec

8、tion,POD)，德国Boehringer Mamuheim公司产品(NO.1684817)。氢化可的松注射液，扬州制药厂产品，20mL/支(5g/L)，批号：980403。六味地黄汤，由熟地黄24g、山茱萸12g、淮山药12g、泽泻9g、茯苓9g、牡丹皮9g组成。上述药材由本校第一附属医院中药房提供，经本校中药鉴定教研室张丹雁老师鉴定。将上述药材置陶器内加水1L浸泡1h后煎煮，沸后1h取出药液，药渣再加水煎煮1h，将两次药液混合浓缩至75mL(每mL含生药1g)，用双层纱布过滤后置4冰箱中保存备用。1.3分组及给药取大鼠30只，随机分为3组，每组10只。正常对照组：蒸馏水灌胃1mL/d，共

9、5d，第3天起肌注生理盐水0.2mL/d，共3d。模型对照组：蒸馏水灌胃1mL/d共5d后，第3天始按肾阴虚造模方法5，肌注氢化可的松0.2mL/d，共3d。六味地黄汤组：六味地黄汤灌胃1mL/d，5d，第3天始按肾阴虚造模方法5，肌注氢化可的松0.2mL/d，共3d。给药结束后断头处死动物，取出胸腺进行凋亡细胞原位末端标记及观察。1.4凋亡细胞原位末端标记石蜡切片常规脱蜡至水，微波10min，PBS洗5min，3H2O2    1各组胸腺皮质、髓质光镜下细胞凋亡情况a、b正常对照组胸腺皮质；c、d模型组胸腺皮质；e、f六味地黄汤组胸腺皮质、胸腺髓质2结

10、果2.1光镜观察正常对照组：在胸腺皮质及髓质部位均能见被着染成棕黄色的凋亡细胞，阳性细胞占整个胸腺细胞比例较少(见封底本文1-a、b)。模型对照组：在胸腺皮质及髓质部位见棕黄色的凋亡细胞较正常对照组明显增多，阳性细胞占整个胸腺细胞的比例增大(见封底本文1-c、d)。六味地黄汤组：在胸腺皮质及髓质部位见棕黄色的凋亡细胞似较正常对照组增多，但较模型对照组明显减少(见封底本文1-e、f)。2.2凋亡细胞计数见表1。3组切片凋亡细胞数经方差分析，差别有非常显著意义。模型对照组凋亡细胞数比正常组多(P0.01)，说明糖皮质激素确有诱导淋巴细胞凋亡作用，而六味地黄汤组凋亡细胞数比模型组少(P0.01)，并

11、接近正常对照组(P0.05)，提示六味地黄汤对氢化可的松诱导的淋巴细胞凋亡具有抑制作用。组别N/只N凋亡细胞/(个*视野-1)正常对照组1081.32±45.25模型对照组10246.26±110.70*六味地黄汤组1096.42±83.08     3组经方差分析P0.01；组间比较，t检验：*与正常对照组比较，P0.01；与模型组比较，P0.01 3讨论细胞凋亡(apoptosis)，又称为细胞程序性死亡或脱噬作用(PCD)，由Kerr于1972年提出3。它是一种主动的由基因调控，不同于坏死的细胞死亡形式。其形态学特征是

12、：细胞体积变小，胞浆浓缩，核仁消失，染色质裂解和固缩，聚积在核膜周围一侧，呈半圆形斑块，进而细胞膜内陷将细胞分割为一个或多个由质膜包裹，内有细胞器及核成分的小体，即凋亡小体(apoptosisbody)。其生化特征是：由于细胞内核酸内切酶活性增高，DNA被剪切成单一的和寡聚的核小体DNA片段(180-200bp或其倍数)，在琼脂糖凝胶电泳上呈梯状条带4。细胞凋亡与免疫系统中免疫细胞的发育分化及行使功能等各个方面有着密切的联系。现有研究表明68：凋亡参与淋巴器官中免疫细胞的成熟和淋巴细胞抗原受体谱的发育；凋亡作为一种调节机制，直接制约免疫应答的过程和强度；凋亡还决定免疫耐受的形成和免疫记忆的产生

13、等。由于细胞凋亡与免疫系统的密切联系，因而免疫细胞的凋亡成为免疫学研究的热点之一。由于细胞凋亡参与免疫系统中免疫细胞的发育分化及行使动能等各个方面，免疫细胞凋亡的异常必将严重影响机体免疫系统的结构与功能。探讨具有免疫调节作用药物对免疫细胞凋亡的影响，对揭示该药物的免疫药理作用机制具有重要意义。寻找免疫细胞凋亡调节药物有利于免疫细胞凋亡相关疾病的治疗。曾有研究表明，糖皮质激素水平升高是肾阴虚证患者体内重要病理改变之一，同时肾阴虚证患者多表现为免疫功能的低下或紊乱5，9，其机制可能与糖皮质激素诱导淋巴细胞，特别是胸腺细胞凋亡有关。六味地黄汤是公认的治疗肾阴虚证的经典古方，临床及实验证实六味地黄汤具

14、有改善肾阴虚证机体免疫状态的作用4，10。本实验结果进一步说明了肾阴虚证的免疫学基础可能与淋巴细胞过度凋亡有关，而六味地黄汤能抑制这种凋亡，亦反证了肾阴虚证的这一本质。糖皮质激素参与体内的应激过程，过度的应激反应，特别是慢性应激反应，能引起应激性的免疫功能低下11。本研究结果表明，六味地黄汤能拮抗糖皮质激素诱导的淋巴细胞凋亡作用。提示该方可能在各种应激引发的免疫功能低下的保健预防及治疗中具有一定的应用前景。淋巴细胞凋亡异常是一些免疫相关性疾病(如放射、化疗、爱滋病等引起的继发性免疫缺陷病)产生的重要病理学基础，或在发生发展过程中出现淋巴细胞凋亡而使疾病恶化进展12。六味地黄汤具有拮抗淋巴细胞凋

15、亡的作用，该方对上述疾病的预防和治疗可能会有一定的效果。(热带医学研究所张奉学老师为本研究提供了大力帮助，特此致谢!)基金项目：广东省中医药管理局课题(编号 97072)作者简介：杜标炎(1962-)，男，副教授杜标炎（广州中医药大学病理教研室，广州510405）徐勤（广州中医药大学病理教研室，广州510405）吴绍锋（广州中医药大学病理教研室，广州510405）罗惠（广州中医药大学病理教研室，广州510405）苏俊芳（广州中医药大学病理教研室，广州510405）钟廷机（广州中医药大学病理教研室，广州510405）参考文献：1杜标炎.肾阴虚造型及补肾中药对小鼠免疫功能的影响J.广州中医药大学学

16、报，1995，12(4)：302杜标炎，徐勤，罗惠，等.六味地黄汤抗糖皮质激素所致小鼠胸腺萎缩的病理学研究J.广州中医药大学学报，1999，16 (2)：1113Kerr J F R,Wyllie A H,Currie A R.Apoptosis: basic biological phenomenon with wideranging implication in tissue kinesticsJ.Br J Cancer, 1972,26:2394Wyllie A H.Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with

17、 endogenous endonuclear activationJ.Nature,1980,284:5555陈小野.脾虚和肾虚动物模型的研究思路J.中国医药学报，1988，3 (1)：646Krammer P H, Berhmann I,Daniel P,et al.Regulation of apoptosis in the immune systemJ. Curr Opin Immunol,1994,6:4767Williams G T.Apoptosis in the immune system:concepts and questionsM.In:Apoptosis and the immune responses. New York:Willey