人原代晶体上皮细胞bFGF多肽和mRNA的表达

1、    人原代晶体上皮细胞bFGF多肽和 mRNA的表达        【摘要】目的为研究后发性白内障的发生机理，检测生长中人晶体上皮细胞(human lens epithelial cells,HLECs)自身是否表达碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)。方法体外培养人晶体上皮细胞，用免疫细胞化学和原位核酸分子杂交的方法，检测HLECs中bFGF多肽和其mRNA的表达。结果用免疫细胞化学和原位核酸分子杂交

2、方法，可检测到生长中的人晶体上皮细胞自身表达碱性成纤维细胞生长因子。结论结合碱性成纤维细胞生长因子促进人晶体上皮细胞生长的作用，推测人晶体上皮细胞自身表达的bFGF，参与促进晶体上皮细胞生长增殖过程。【关键词】晶体白内障上皮细胞生长因子Expression of bFGF in primary human lens epithelial cellsLiu Dongling,Wu Jingan. Department of Ophthalmology,First Hospital,Beijing Medical University,Beijing 100034【Abstract】Objecti

3、veTo study the mechanism of after cataract formation and investigate the expression of basic fibroblast growth factor(bFGF) in primary human lens epithelial cells(PHLECs). MethodsHuman lens epithelial cells were cultured in vitro, and the expression of bFGF was detected with immunohistochemistry and

4、 in situ hybridization.ResultsPHLECs express bFGF in protein and mRNA levels.ConclusionBased on bFGF promoting PHLEC growth and differentiation,the results suggest that bFGF from PHLECs take part in promoting such cell growth and differentiation. 【Key words】LensCataractEpithelial cellsGrowth factor后

5、发性白内障(简称后发障)因其高发生率和明显影响白内障囊外摘除术的术后效果，已引起眼科学界广泛关注。后发障形成的主要原因，是晶体囊袋内残留上皮细胞生长、增殖、迁移和纤维分化，在后囊表面形成混浊薄膜。细胞生长增殖与多种因素有关，成纤维细胞生长因子在多种因素中起着重要作用。自70年代从牛脑垂体中分离纯化出碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)，以后又在同样组织中分离纯化了酸性成纤维细胞生长因子。此后，有学者确认了人房水中有bFGF的存在1；bFGF对人晶体上皮细胞有明显的促进增殖和分化的作用2；人白内障晶体上皮细胞内有bFGF及其受体3；在后

6、发障形成中，晶体上皮细胞自身是否表达bFGF，对研究和预防后发障的形成有很重要意义。资料和方法一、人晶体上皮细胞的培养1.取材：眼球取自出生后至2岁死者15例(30只眼)，于死后12小时内无菌取材，0.25%氯霉素纱布包裹，置冰壶内送回实验室。2.操作方法：将眼球浸泡于75%酒精30秒钟后，用生理盐水洗6次，移至超净工作台内；自角膜缘后2 mm处环行剪开巩膜，分离去除玻璃体、角膜及虹膜。以D-Hanks液洗一次；在解剖显微镜下剪除晶体周围悬韧带，自晶体赤道后约1 mm环行剪开后囊膜，将前囊膜等分为四部分，揭下附着上皮细胞的前囊膜，接种于25 ml培养瓶内预置的盖玻片上，置于37、5%CO2培养

7、箱中，待组织块贴壁4小时后，加入含20%胎牛血清DMEM培养液2.5 ml，继续培养1周后，换液一次，以后每3天换液一次。二、人原代晶体上皮细胞内bFGF多肽的检测1.试剂：第一抗体为兔抗人bFGF特异性多克隆抗体，美国Sanata Cruz Biotechnology 公司产品。第二抗体为生物素化羊抗兔IgG，特异复合物为辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，以及DAB等其它试剂均购自北京中山生物制品公司。2.操作方法：采用免疫细胞化学SP法。取出原代培养汇合60%70%的细胞爬片，D-Hanks液洗3次，依次经过10%中性福马林液固定30分钟，分别以3%H2O2 30分钟、110正常羊血清40分钟

8、封闭内源性过氧化物酶；第一抗体(1100)结合，置湿盒内4过夜，第二抗体结合30分钟，辣根过氧化物酶标记链霉卵白素结合30分钟；新鲜配制DAB显色液，显色510分钟，每一步骤间以0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，每次3分钟。苏木素(pH 8.0)复染5分钟，自来水冲洗3分钟，脱水，透明，封片。3.对照组设置：阴性对照组分别以PBS代替第一抗体、第二抗体和辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，阳性对照为人血管平滑肌细胞爬片。4.生物显微镜观察：阳性信号表现为细胞内黄色、淡黄色点网状着色。三、人原代晶体上皮细胞内bFGF的mRNA检测1.试剂：人bFGF的mRNA全长cDNA序列探针由军事医

9、学科学院提供。地高辛-DNA标记及检测试剂盒为德国 Boehringer Mannheim公司产品。其它试剂严格按照RNA原位杂交要求配制，包括焦磷酸二乙酯(DEPC)水，0.3% Triton X-100，蛋白酶K，PBS，标准柠檬酸盐-氯化钠液(SSC)，硫酸葡聚糖，缓冲液，预杂交液(内含50%甲酰胺、10%硫酸葡聚糖、Denhart液、12 mmol/L EDTA、10 mmol/L Tris-HCl、30 mmol/L NaCl、0.5 mg/ml酵母tRNA)，0.2 mol/L HCl，RNA酶(RNase)等。2.操作方法：将cDNA探针标记后，-20保存备用。取原代培养汇合60

10、%70%的细胞爬片，经4%多聚甲醛固定1015分钟，0.3% Triton X-100洗片5分钟，0.2mol/L HCl酸化5分钟，蛋白酶K消化37，5分钟，每步骤间用PBS洗3次。梯度酒精脱水，预杂交37，1小时；以1.5 ng/l探针浓度的杂交液滴于细胞爬片，43杂交17小时，顺序以2×、1×、0.5×SSC洗片，120正常羊血清封闭20分钟，15 000抗地高辛抗体结合，37，1小时；以新鲜配制硝基蓝四氮唑(NBT)与5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)显色液滴片，室温下避光显色2小时，自来水冲洗，番红复染，自然干燥。3.对照组设置：分别用PBS代替

11、bFGF的cDNA探针以及RNase预处理细胞爬片作为阴性对照。4.生物显微镜观察：bFGF的cDNA探针与细胞内相应mRNA杂交的阳性信号，表现为紫蓝色颗粒，大部分阳性信号于胞浆内，部分信号与胞核重叠。结果一、bFGF免疫细胞化学检测实验组全部染片中，晶体上皮细胞内均可见阳性信号，染色部位位于细胞膜还是细胞浆，抑或两部位均存在，细胞核内是否有所表达，此次免疫细胞化学检测尚不能确定。阴性对照片内未见阳性信号(1，2)。1 原代培养人晶体上皮细胞bFGF免疫细胞化学，细胞内可见黄色、淡黄色点网壮阳性信号（免疫组化染色×600）2 免疫细胞化学阴性照组，细胞内无阳性信号，苏木精复染（免疫

12、组化染色×400）二、bFGF的mRNA原位核酸分子杂交检测实验组全部细胞爬片中，可见细胞浆内bFGF的mRNA阳性杂交信号颗粒，阴性对照片细胞内未见阳性信号颗粒(3，4)。4 原位杂交阴性对照组，细胞内未见阴性信号，番红复染（原位杂交染色×400）讨论细胞分子生物学已经证实，细胞受损伤后引起的细胞增殖行为，是细胞对损伤的反应，在这一反应过程中有许多介质参与，多肽生长因子在这些介质中起着重要的作用。它们由细胞自分泌/旁分泌，或者释放产生，作用于靶细胞，表现为强效的促进或抑制细胞增殖作用。促进晶体上皮细胞增殖的因子包括bFGF、EGF、IGF、TGF-以及IL-1等。生长因子

13、通过促使G0期和G1期细胞跨越限制点，进入增殖状态，其中bFGF被认为是诱导这一过程的启动因子，在时间和效应上与其它因子连续、协同作用，使细胞完成有丝分裂。以往有关晶体上皮细胞bFGF的研究进行了一些工作。Namiki4将家兔分成晶体超声乳化吸出术组和联合人工晶体植入术组，手术前后用ELISA方法检测房水中bFGF含量变化，结果两组间无差异。人工晶体植入组房水bFGF含量，术前在10 pg/ml以下，术后第1天增至300±280 pg/ml，术后1周达高峰，为450 pg/ml，术后8周仍维持在100200 pg/ml。Sculz等5用Northern blot法检测到牛晶体上皮细胞

14、中有bFGF的表达。Lovicu等6用免疫细胞化学的方法检测到大鼠的新生鼠、乳鼠及成年鼠晶体前囊膜内存在bFGF。McAvoy等7向大鼠晶体上皮细胞培养液中加入不同浓度bFGF，呈现不同的作用，最大半数有效量在150 pg/ml、30 ng/ml和40 ng/ml时，分别起促增殖、促迁移和促分化作用。曾有报道培养人晶体上皮细胞，用ELISA法动态检测培养液中bFGF含量变化，结果培养1天为470 pg/ml，2天为310 pg/ml，1周为269 pg/ml。Nishi等8培养人晶体上皮细胞，加入bFGF后，用H3-TdR掺入法计数其掺入量，结果显示H3-TdR的掺入量在实验组明显高于对照组，

15、表明bFGF对晶体上皮细胞起促进增殖的作用。 Reddy等2以含10 ng/ml bFGF的培养液培养人晶体上皮细胞，观察对上皮细胞的作用，同时还用免疫电镜的方法观察bFGF受体数目的变化，结果显示bFGF受体数目有变化，以及bFGF对晶体上皮细胞起促进增殖和分化作用。随着培养时间的延长，bFGF受体数目减少，其促增殖作用也明显减弱。Majima等3报道，用免疫细胞化学法检测到原位人白内障晶体上皮细胞有bFGF及其受体存在。基于bFGF对晶体上皮细胞促增殖作用比较明显，为深入探讨它在人类晶体上皮细胞生长过程中有无自身bFGF表达，本实验在多肽和mRNA水平，以免疫细胞化学和原位核酸分子杂交方法

16、，检测原代生长中人晶体上皮细胞bFGF表达情况。免疫细胞化学的方法是根据抗原抗体特异结合的原理，利用已知抗体检测组织细胞中特异蛋白质的方法。SP法在免疫细胞化学方法中是一种较新的、特异性强且稳定可靠的方法，其结果可以显示有无被检多肽或蛋白质的存在。原位核酸分子杂交的方法是根据核酸分子碱基互补结合的原理，用已知核酸片段探测细胞中相应核酸的存在。地高辛-DNA标记检测法，具有高度灵敏性和特异性，安全稳定，可避免内源性干扰。以上两种方法结合，在蛋白(多肽)和mRNA水平检测，可以从两个不同角度说明靶物质的表达与否。本实验应用特异性兔抗人bFGF多克隆抗体和人bFGF全长序列cDNA探针，检测生长中人

17、晶体上皮细胞bFGF多肽及其mRNA的表达，结果显示两者均有表达。与1997年较新报道9用RT-PCR法所做的结果相吻合。根据其他研究者的报告和本实验结果，我们认为在人晶体上皮细胞生长过程中，其自身仍表达碱性成纤维细胞生长因子，后者亦参与启动晶体上皮细胞生长、增殖及分化。如进一步实验，可以从抑制碱性成纤维细胞生长因子的表达，对晶体上皮细胞增殖的影响中观察到相应的结果。参考文献1Tripathi RC,Borisuth NSC,Tripathi BJ.Detection, quantification, and significance of basic fibroblast growth fa

18、ctor in the aqueous humor of man,cat,dog and pig.Exp Eye Res,1992,54:447-454.2Reddy VN,Ibaraki N ,Lin LR.Changes of fiber differentiation in human lens epithelial cells exposed to growth factors in several subcultures.Invest Ophthalmol Vis Sci,1995,36(Suppl):S260.3Majima K,Kousaka M.The existence of

19、 epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor in human lens epithelial cells.J Jpn Ophthalmol Soc,1995,99:81-86. 4Namiki M.Quantification of basic fibroblast growth factor (bFGF)and transforming growth factor (TGF) in rabbit aqueous humor after intraocular lens implantation.J Jpn Ophth

20、almol, 1994,98:334-339.5Schulz MW,Chamberlain CG,de Iough RU,et al.Acid and basic FGF in ocular media and lens implications for lens polarity and growth patterns.Development ,1993 ,118: 117-126.6Lovicu FJ,McAvoy JW.Localization of acid fibroblast growth factor,basic fibroblast growth factor and heparan sulphate proteoglycan in rat lens:implications for l