内源性接触激活系统对单核细胞粘附的影响

1、    内源性接触激活系统对单核细胞粘附的影响        摘要目的：研究接触激活系统对尿激酶型纤溶酶原激活物（U-PA)引起单核细胞粘附的影响及它们之间的相互关系。方法：3H-TdR标记的U937细胞培养于24孔板，在高分子激肽原(HK/HKa)，激肽释放酶(kallikrein,KK),因子(factor )和纤溶酶原(plasminogen)的作用下，观察U937细胞的粘附情况。结果：Hka、KK抑制U-PA引起的单核细胞粘附，因子X和Plasminogen促进单核细

2、胞粘附。结论：接触激活系统是单核细胞粘附的重要调节因素。主题词尿激酶； 单核细胞； 细胞粘附中分类号Q461文献标识码 A文章编号1000-4718(2000)03-0233-04 Effect of contact system in monocyte adhesion induced by urokinase-type plasminogen activatorLIU Jian-xia, ZUO Jian-ling, QIN Lei, QIAN Hai-xin(The First Affiliated Hospital of Suzhou Medical College, Suzhou 2

3、15006, China)LIU Jian-ning(Vascular ReserchLaboratory, Deaconess Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02215, USA)Abstract AIM:To study the effect of contact system in monocyte adhesion induced by urokinase-type plasminogen activator (U-PA). METHODS:U937 cells were labeled with H t

4、hymidine in the culture medium, test reagents were added into the cell suspension in 24-well plates. The counts*min-1 were counted in a liquid scintillation counter. RESULTS:U-PA-induced monocyte adhesion was inhibited by high-molecular-weight kininogen and kallikrein, and promoted by factor and pla

5、sminogen. CONCLUSION:these contact system proteins may be important modulators of U-PA-induced monocyte adhesion, a process which is involved in many pathophysiological events.MeSH Urokinase; Monocytes; Cell adhesion单核细胞粘附参与许多病理生理过程如创口愈合、感染、肿瘤浸润和转移等。尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator,U

6、-PA）在单核细胞粘附中起着重要作用,它和U-PA受体结合后，通过cAMP介导的信号传递，引起细胞粘附，从而引发一系列病理生理反应。由于U-PA和内源性接触激活系统中的3种因子激肽释放酶（kallikrein,KK）、高分子量激肽原（high-molecular-weight kininogen,HK/HKa）、十二因子（）及纤溶酶原（plasminogen）与U-PA在功能上密切相关，故本文探讨4种因子对U-PA引起单核细胞粘附的影响。材料和方法一、试剂和细胞株人激肽释放酶、HK(HKa)和(a)购于Enzyme Research Laboratories(美国)；U-PA(MW 54 KD

7、a)购于Green cross（日本）；RPMI 1640购于Gibco BRL(美国)；氟磷酸二异丙酯（diisopropyl fluorophosphate,DFP)及胎牛血清（fetal calf serum,FCS）购于Sigma(美国),单核细胞株U937购于Type Culture Collection(美国)。酶的底物S2444和S2302购于Kabi(美国)。二、U-PA、激肽释放酶、a活性灭活在室温下,U-PA、激肽释放酶、a分别在DFP(5 mmol/L)中孵育2 h,充分透析后用S2444检测U-PA的酶活性,S2302检测激肽释放酶和a的酶活性，经DFP处理后，它们的酶

8、活性均消失。三、细胞培养和细胞粘附测定单核细胞株U937细胞生长于RPMI 1640培养基中,含10% FCS;青霉素(100 U/mL),链霉素(100g/mL),二性霉素B(0.25g/mL),在37,5% CO2培养。细胞粘附测定按WALTG1方法略加改进。U937细胞(1×106/mL)和3H-TdR(3.7×10Bq/mL)共同培养24 h,离心收集细胞(350×g,4 min,4),用无血清RPMI 1640洗涤3次，用含10% FCS的RPMI 1640重悬细胞(1×106/mL)，加入被测试剂后，在24孔板中（300L/孔）37,5% C

9、O2,培养17h，去上清，用PBS洗涤3次，残留的细胞即为粘附在24孔板上的单核细胞。每孔加入1 mL裂解液(10% glycerol,0.2% sodium dodecyl sulfate,0.2% tritonX-100),每1 mL裂解物加入10 mL液闪液（formula-989 high flash-point cocktail),用液闪仪测定Counts.min-1,单核细胞粘附的程度用每1000个细胞所对应的Counts.min-1值表示。结果一、U-PA增强U937细胞的粘附作用按方法所述，U-PA的浓度选择05 nmol/L和U937细胞共同培养，发现细胞的粘附作用随U-PA

10、的浓度增高而增强。未发现对照组细胞粘附现象发生（见1)。用DFP预处理灭活U-PA的酶活性后，U-PA的这种促粘附作用不受影响（见2B）。二、HK抑制U-PA引起的细胞粘附HK和HKa是血清中的抗粘附蛋白，其中HKa的作用更强。U937细胞培养在含10% FCS和10 nmol/L U-PA的培养基中，再加人HK（含10% Hka），HK的浓度由0 nmol/L递增至10 nmol/L。1显示：HKa可抑制U-PA引起的细胞粘附，HKa对细胞的抗粘附作用随着HKa浓度的增高而加强(见1）。三、激肽释放酶对U-PA引起细胞粘附的影响由于HKa的抗粘附作用明显强于HK，而激肽释放酶催化HK转化为H

11、Ka，因此我们也探讨激肽释放酶在细胞粘附中的作用。U937细胞培养在含2 nmol/L的U-PA的培养基中，激肽释放酶的浓度范围0640nmol/L，结果显示：低浓度的激肽释放酶（200nmol/L）能轻度增强细胞粘附作用。而高浓度激肽释放酶（400nmol/L），则起抑制作用（见2A）。用DFP预处理使激肽释放酶的酶活性被灭活，激肽释放酶抑制作用即消失（见2B）。     Fig1U-PA induced monocyte U937 adhesion and the anti-adhesion effect of Hka3H-labeld U937 c

12、ells at 1×106/mL were incubated with U-PA (010 nmol/L) in the absence or the presence of Hka in 24-well plates. The quantity of the adherent cells were measured and expressed in counts.min-1     Fig 2Effect of KK on U-PA-induced monocyte U937 adhesionA.3H-labeled U937 cells

13、were cultured in a medium containing 2 nmol/L U-PA and KK(0640 nmol/L). B.3H-labeled U937 cells were incubated with (a) control , (b)1nmol/LU-PA, (c)1nmol/L DFP-U-PA, (d)1nmol/L U-PA and 400nmol/L KK, (e)1nmol/L U-PA and 400 nmol/L DFP-KK. The quantity of the adherent cells were expressed in counts.

14、min-1四、因子和纤溶酶原在细胞粘附中的作用因子和纤溶酶原具有促单核细胞粘附作用，当因子和纤溶酶原存在时，U-PA促进单核细胞粘附作用明显加强，预先用DFP处理，将其酶活性灭活，不影响其调节作用（见3）。     Fig 3Effects of and plasminogen on U-PA induced monocyte U937 cell adhesion3讨论已知纤溶和凝血系统之间有密切的关系，U-PA和内源性接触激活系统各因子（a,HKa,KK）相互作用，调节凝血和纤溶反应。近年的研究表明，U-PA可诱导单核细胞粘附，该反应参与多种病理生理反

15、应。内源性接触激活系统对U-PA的这种作用有何影响，尚未见报道。我们的实验表明，在体外实验中，内源性接触激活系统3因子（高分子激肽原HK/HKa、激肽释放酶KK、十二因子）和纤溶酶原是调节U-PA诱导的单核细胞粘附的重要因素。HK/HKa及激肽释放酶可下调U-PA诱导的单核细胞粘附，及纤溶酶原可上调U-PA诱导的单核细胞粘附。Waltz等1报道，U-PA和U-PA受体结合后，通过cAMP介导的信号传导，引起单核细胞粘附，从而触发人体一系列生理和病理反应。在实验中，U-PA经DFP预处理去除酶活性后，其作用不受影响，由此推测，U-PA的作用与酶活性无关。有学者报导，U-PA存在EFG区域，该区域

16、与U-PA受体结合，激发一系列反应2。在我们实验中，U-PA的浓度1 nmol/L,比人体血浆的浓度高10倍以上，因为在某些病理状态下，如肿瘤转移，炎症，风湿病，细胞表面U-PA和U-PA受体过表达，产生很高的局部浓度3，4。HK/HKa、激肽释放酶与U-PA及其受体之间存在着复杂的相互作用，Colman等5报道，U-PA受体有3个结合位点，HKa和其中2个结合，影响U-PA和其受体的结合，从而抑制了U-PA的促粘附作用。激肽释放酶可以激活单链U-PA转变为双链U-PA6，后者活性更强（约100倍），它和PAI-1快速结合，被细胞吞饮而灭活7。高浓度激肽释放酶促进HKHKa，抑制细胞粘附。在实

17、验中，激肽释放酶的调节作用较为复杂，在低浓度时，表现为轻度的促细胞粘附作用，我们认为可能与其将单链U-PA转变为双链有关。在高浓度时（400nmol/L以上），它表现为抑制作用为主。我们推测激肽释放酶下调U-PA的粘附作用通过以下2个途径：KK促进牛血清HKHKa；促进单链U-PA双链U-PA,后者和PAI-1结合而灭活。由于血浆中激肽释放酶的浓度为500600nmol/L，因此，激肽释放酶在体内主要表现为抑制作用。用DFP预处理激肽释放酶，其酶活性消失后，对U-PA的调节作用也随之消失，所以激肽释放酶的作用和酶活性有关。、纤溶酶原和U-PA之间也有着复杂的相互作用，a可以促使激肽释放酶前体转

18、变为激肽释放酶，后者可使HKHKa，单链U-PA双链U-PA,双链U-PA可激活纤溶酶原，从而引发一系列瀑布反应。我们用DFP灭活a的活性，并不影响a的调节作用。可见，a的作用和酶活性无关。a和纤溶酶原上调U-PA诱导单核细胞粘附，其作用机制尚不清楚，有待进一步研究。总之，接触激活系统和U-PA在体内广泛存在，并且相互影响，在U-PA引起单核细胞粘附过程中，接触激活系统是重要的调节因素。刘建夏（苏州医学院附属第一医院，江苏 苏州 215006）左剑玲（苏州医学院附属第一医院，江苏 苏州 215006）秦磊（苏州医学院附属第一医院，江苏 苏州 215006）钱海鑫（苏州医学院附属第一医院，江苏

19、苏州 215006）LIU Jian-ning（Vascular Reserch Laboratory, Deaconess Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02215, USA）参考文献1Waltz DA, Sailor LZ, Chapman HA, et al. Cytokines induce urokinase-depend adhesion of human myeloid cells. A regulatory role for plasminogen activator inhibitors J.

20、J Clin Invest, 1993, 91: 15411552.2Wei Y,Waltz DA, Rao N, et al. Identification of the urokinase receptor as an adhesion receptor for vitronectin J. J Biol Chem, 1994, 269: 3238032388.3Blasi F. Urokinase and urokinase receptor: a paracrine/autocrine system regulating cell migration and invasiveness J. Bioessays,1993， 15: 105111.4Jankun J, Merrick HW,Goldblatt PJ. Expression and locali