人类皮肤及汗腺附属器官在胚胎不同发育阶段的基因表达特征研究

1、人类皮肤及汗腺附属器官在胚胎不同发育阶段的基因表达特征研究摘要 目的 总结人胎儿皮肤及其附属汗腺发育过程中关键形态发生点，分析人类胎儿皮肤及汗腺附属器生理发育过程中的基因表达规律。方法 采用ABC法免疫组化染色和逆转录-多聚酶链式反应等方法。结果 根据皮肤汗腺结构形成的时序大致划分为汗腺形成初期(胚芽或原基期)、汗腺形成中期和汗腺成熟期；胎儿汗腺细胞能用CK19、CK7、CKS、CK18和CEA等生物分子标记。CK7、CKS、CK18和CAE只在皮肤组织内的汗腺细胞中表达，而在真皮层和表皮层的其它细胞呈阴性反应；RT-PCR结果显示EGF、EGFR基因的表达与汗腺的发育有密切的关系；结论 皮肤

2、正常发育的过程是基因调控有序表达的过程，修复和再生的过程则是基因再次程序化的过程；CK7、CKS、CK18和CAE是相对较特异的汗腺细胞标记物；EGF、EGFR、FGF10和Bek等基因既参与了汗腺的原基发生和形态建立，也参与了汗腺功能的维持，是调控汗腺发育和形态发生的重要功能因子。关键词：人类皮肤及汗腺附属器官；胚胎不同发育阶段；基因表达特征外分泌汗腺(eecrine sweat gland)是皮肤功能结构完整的重要附属器官之一，只发生于胚胎的早期发育阶段，出生后不再生成新汗腺，各种原因所致的皮肤损伤至今也无法达到解剖结构与生理功能的完全修复，正是受困于这一发育特性1，同时也是由于人们尚未完

3、全了解皮肤细胞增殖分化与再生过程中的基因调控机制，因而缺乏有效的促增殖分化与再生修复手段。阐明细胞分化的基因调控机制和可能影响因素、筛选特异性发育基因，诱导和调节成体干细胞的定向分化或有序横向分化，将有望为从基因水平调节汗腺修复或再生及完善皮肤功能开辟一条新的治疗方法和途径2。一、材料与方法 （一）材料由本院妇产科提供胎龄(GEA)为6-36周(胎龄以母亲自诉孕期史结合胎儿头臀长估计)的终止妊娠的胎儿，标本获取得到家属同意并严格遵循伦理原则。产后半小时内取头部、眼睑、耳廓、背部、腹部及手指等不同部位皮肤，确定所有取材部位均未经任何治疗并严格按无菌原则操作。（二）方法1、材料处理方法用于逆转录多

4、聚酶链反应(RT-PCR)进行基因表达检测的部分立即置液氮冻存；进行组织形态学观察的包埋切片并置于4%多聚甲醛/0.1MPBS(含1/1000DEPC)固定；另有少部分用于消化分离汗腺组织。2、统计学方法采用SPSS13.0统计软件进行数据统计描述，计量资料进行t检验或者方差分析及相关与回归分析。各项指标以均数士标准差表示，P<0.05或P<0.01表示有统计学意义。二、结果1、不同发育阶段胎儿皮肤及附属汗腺的ABC法免疫组化染色光镜下可见不同发育阶段的胎儿皮肤具有典型的组织学结构，在E10周表皮仅由1-2层细胞组成周皮，周皮细胞呈空泡状，含有较多的脂类物质，表皮基底层细胞排列疏松

5、无极性(图lA，B)；E12周后表皮基底层细胞开始呈栏栅状排列，表皮嵴形成，并出现呈局灶增殖且相间分布的细胞团(图1-C)，考虑为附件尤其是发育中毛囊的胚芽(或原基)，间质细胞包绕其周围(图1-D)；E13-14周皮肤表皮基底层向上由2-4层细胞组成，排列无层次，毛囊胚芽细胞增殖下陷，毛乳头形成(图1-E)，偶尔可见汗腺原基的出现；E16周后周皮细胞开始脱落，表皮和真皮层均增厚，汗腺原基内细胞呈条索状向真皮深层生长(图1-F)； 图1-ABCDEF汗腺形成初期 图2-ABCDEF汗腺形成中后期E17周开始出现皮下脂肪组织，在毛囊的漏斗部和峡部交界处发生的上皮芽向斜侧深部突入并形成皮脂腺(图2-

6、A)；E15-18周足底汗腺原基处汗腺上皮向真皮层进一步生长(图2-B)；在E20周前后能观测到完整的毛囊、皮脂腺结构；E2224周，皮肤表皮由35层规律排列的表皮细胞组成，毛囊和皮脂腺等皮肤附件结构初步形成，汗腺形成导管部和分泌部(图2-C)，腔壁细胞排列整齐，可见构成汗腺的三种细胞形态(图2-D)；E26-32周，皮肤表层出现角化，汗腺、毛囊和皮脂腺结构完整、数量稳定，毛干已形成，皮脂腺内可见脂性分泌物(图2-E，F)。根据光镜下胚胎皮肤发育过程中汗腺结构形成的时序，所获取的胎儿皮肤大致划分为3个发育阶段：汗腺形成初期(胚芽或原基期)(E12-15周)、汗腺形成中期(E16-24周)和汗腺

7、成熟期(E25+周)。2、角蛋白系列(CKS)的表达:图2汗腺细胞的特异性标记分子的表达A. CK19的表达出现在表皮基底层细胞、部分毛囊和汗腺等部位的细胞内，图1-A显示了CK19在汗腺分泌部及导管部细胞胞浆中强阳性表达； CK7、8、18的表达出现在汗腺的分泌部和导管真皮部，导管的表皮内段未见阳性细胞出现图2-B. 显示CK7在汗腺分泌部细胞胞浆中强阳性表达；图2-C.显示CK8在汗腺组织中的表达；图2-D.显示 CK18在汗腺组织中的表达；图2-E.显示汗腺导管的表皮的表皮内段和真皮段上部未见CK7， 8， CEA的表达；图2-F. 显示CEA在汗腺组织中的表达。3、RT-PCR检测不同

8、发育阶段人胎儿皮肤及附属汗腺的基因表达EGF和EGFR基因的mNRA经过RT-PCR扩增后，得到特异性的DNA片段分别由149bp和168bp组成。RT-PCR结果显示EGF基因在胚芽期即有表达，随着胎龄的增加，EGF的表达量总体呈高水平趋势；而EGFR基因的表达量稍稍滞后，且其表达量增幅最快是在汗腺形成初期和中期，成熟期EGF及其受体的基因则持续表达。不同发育阶段汗腺组织中EGF及其受体EGFR的基因表达情况组别汗腺原基期汗腺形成中期汗腺成熟期EGF9.1±4.235.5±12.6a)52.6±11.3EGFR26.9±6.640.2±9.3

9、a)46.3±11.9注a)：与汗腺原基期比较，P值<0.05三、结论根据皮肤汗腺结构形成的时序大致划分为汗腺形成初期(胚芽或原基期)、汗腺形成中期和汗腺成熟期；胎儿汗腺细胞能用CK19、CK7、CKS、CK18和CEA等生物分子标记。CK7、CKS、CK18和CAE只在皮肤组织内的汗腺细胞中表达，而在真皮层和表皮层的其它细胞呈阴性反，CK19也不是表皮干细胞的特异性标记物。由于EGFR主要在正常成人皮肤表皮基底层细胞表达，本次研究的RT-PCR结果表明EGF及其受体EGFR积极地参与了皮肤及汗腺的形态发生过程，在皮肤及汗腺的功能维持中起着重要的作用。四、讨论本研究证实不同发育

10、阶段胎儿的皮肤具有其特定的组织学结构，表皮嵴、毛囊胚芽和汗腺原基的形成紧凑而又有序。在身体不同部位数量和深浅各异的表皮嵴的出现，使得组成皮肤的表皮和真皮结构更加稳定，也把发育信号相互反馈到对方纵深，精致的调节皮肤附件如汗腺、毛囊的发育；在时间上，毛囊胚芽的发育稍早于汗腺原基，但毛囊胚芽和汗腺原基向真皮生长的方式不同，毛囊胚芽是一种以表皮基底层结构向真皮下凹陷形成，而汗腺则是细胞以条索状结构向真皮下生长3。皮肤的组织结构和所属附件大约在胎龄25-32周(E25-32W)就基本稳定下来。根据光镜下胚胎皮肤发育过程中汗腺器官结构形成的时序，本研究将胎儿皮肤大致划分为3个发育阶段：汗腺形成初期(胚芽或

11、原基期，E12-14w)、汗腺形成中期(E15-24W)和汗腺成熟期(E25-32W)。汗腺只发生于胚胎早期发育阶段，出生后即不再有新汗腺生成，使得汗腺胚胎期发育的研究与成体汗腺毁损后的修复与再生治疗之间关系更加密切。细胞角蛋白是上皮细胞中等纤维蛋白的统称，只在上皮细胞中表达，是构成上皮细胞内细胞骨架的中间纤丝类蛋白质，是维持细胞形态的重要蛋白。鉴于在特定类型的细胞内存在特定多肽组合的不同细胞角蛋白的表达，因此通过检测特定多肽组合的不同细胞角蛋白的表达常用来鉴别和分类上皮细胞4。本次ABC免疫组化的结果表明：CK19的表达出现在表皮层基底层细胞、部分毛囊和汗腺导管部和分泌部细胞中，而CK7、8

12、和18的表达则特异性的出现汗腺的分泌细胞和分泌部相连的弯曲导管部，导管的表皮内段和表皮层细胞未见阳性细胞出现。CK19常用于标记和筛选表皮干细胞，但其在汗腺细胞中的阳性表达和汗腺组织结构中尚未证实存在干细胞的事实表明：CK19也不是表皮干细胞的特异性标记物。EGF和EGFR在皮肤及汗腺发育中的分布和作用早已是业界注视的焦点，Saga5等利用对活性EGF受体特异的单抗和激光共聚焦扫描显微镜，发现在汗腺分泌细胞、旋管和真皮内直管的腔面和外周细胞的胞核呈阳性染色。汗液中也含有EGF，顶浆汗液中GEF的含量比外分泌汗液更多(可达50倍)，在外分泌汗液中EGF的浓度(EGF/单位汗腺体积)可随汗液量的增

13、加成同向增加。有EGF，顶浆汗液中GEF的含量比外分泌汗液更多(可达50倍)，在外分泌汗液中EGF的浓度(EGF/单位汗腺体积)可随汗液量的增加成同向增加；Wislet6等利用125I-EGF结合试验和免疫组化方法研究了EGF受体在皮肤中的定位，发现外分泌汗腺的真皮导管高水平表达EGF受体。参考文献1 周岗,付小兵. 汗腺中EGF、EGFR、IL和CKs等基因的表达特征及意义J. 创伤外科杂志, 2005,(05) . 2 周岗,付小兵,陈伟,李海红,姜笃银,白晓东,雷永红,孙同柱. 胎儿皮肤EGF、EGFR基因表达特征及与汗腺形成的关系研究J. 创伤外科杂志, 2006,(01) . 4宗守凯,梁自乾,欧邦军. 局部应用重组人EGF对糖尿病大鼠烫伤创面EGF受体及其mRNA表达的影响J. 中国修复重建外科杂志, 2010,(02) .5SagaK.Stureurtenadufnctionofhmu