转化生长因子-β3在2,3,7,8-四氯二恶英诱导的胎鼠腭裂组织中

1、转化生长因子-3在2,3,7,8-四氯二噁英诱导的胎鼠腭裂组织中的表达变化蒲亚兰，刘丽玲，甘立强，傅跃先基金项目 重庆市自然科学基金重点项目（2009BA5085）通信作者 傅跃先，电话：（023）63632270，Email：yuexianfu (400014 重庆，重庆医科大学儿童发育疾病研究省部共建教育部重点实验室)提要 目的 检测腭发育关键时段腭突组织中转化生长因子3（Transforming growth factor-3,TGF-3）的表达变化，探讨TGF-3在2,3,7,8-四氯二噁英(2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p- dioxin, TCDD）诱导C5

2、7BL/6J胎鼠腭裂发生中的作用。方法 在小鼠怀孕第10天（Gestation day 10,GD 10），实验组以TCDD 64 µg/kg灌胃，对照组以玉米油16 ml/kg灌胃，于GD 18.5解剖显微镜下观察胎鼠腭裂的发生率，并于GD 13.5、GD 14.5和GD 15.5剪取胎鼠腭突组织提取RNA及蛋白，采用RT-PCR和Western blot分别检测腭突组织中TGF-3 mRNA和TGF-3蛋白的表达情况。结果 GD 18.5实验组腭裂的发生率为100%（39/39），对照组无腭裂发生(0/42)。GD 13.5、GD 14.5及GD 15.5实验组TGF-3 mRN

3、A和TGF-3蛋白的表达均较对照组显著增高（P<0.05）。结论 TCDD可诱导C57BL/6J胎鼠形成稳定的腭裂实验动物模型，并显著上调胎鼠腭突组织中TGF-3的表达，TGF-3的过高表达可能是TCDD诱发先天性腭裂的主干信号通路之一。关键词腭裂；2,3,7,8-四氯二噁英；转化生长因子3中图法分类号 R726.2 文献标识码 AThe expression of TGF-3 in 2, 3, 7, 8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin induced palatal cleft in mice PU Yalan, LIU Liling, GAN Liqiang,

4、 FU Yuexian (Department of Key Laboratory of Developmental Diseases in Childhood，Ministry of Education，Chongqing Medical University, Chongqing, 400014，China)Abstract Objective To explore the effect of transforming growth factor-3 (TGF-3) on palatal cleft of C57BL/6J mice induced by 2,3,7,8-Tetrachlo

5、rodibenzo- p-dioxin(TCDD) . Methods On gestation day 10(GD 10), the pregnant mice were randomly divided into two groups: the treated group mice were dosed with 64 µg TCDD/kg body weight, while the control group mice received 16 ml corn oil/ kg body weight. The embryos were examined under stereo

6、microscope to detect the incidence of cleft palate on GD 18.5, and the palatal shelves were dissected from the embryos for RNA and protein extractions on GD 13.5, GD 14.5 and GD 15.5. At last，the expression of TGF-3 mRNA and protein were respectively investigated by RT-PCR and Western blot. Results

7、Total frequency of clefts was 100% in TCDD group (39/39), and there was no cleft in the control group (0/42). The expression of TGF-3 mRNA and protein were gradually up-regulated in TCDD group on different phases of the developing palatal shelves(P0.05). Conclusion TCDD can induce a stable formation

8、 of cleft palate and up-regulate the expression of TGF-3, and the over expression of TGF-3 might be a key signal pathway resulting in TCDD-induced cleft palate.Key words cleft palate； 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin； transforming growth factor-3Supported by the Key Program of National Science Fo

9、undation of Chongqing (2009BA5085). Corresponding author: FU Yuexian, Tel: 86-23-63632270, E-mail:yuexianfu4先天性腭裂是由遗传和环境因素相互作用导致的多因素畸形。在众多环境因素中，2,3,7,8-四氯二噁英(2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin, TCDD）被引起了广泛的重视。研究证实，TCDD是毒性最强的环境致畸物并可诱发小鼠腭裂1。课题组前期研究发现，TCDD诱导的胎鼠腭裂其腭突组织中转化生长因子-3（Transforming growth fact

10、or-3, TGF-3）的表达在孕第14.5天（Gestation day 10,GD 14.5）明显增高2，但对于整个腭突融合过程中TGF-3的表达变化情况，罕见国内外相关报道。本研究在前期研究的基础上，着重对腭发育的主要时点腭突组织中TGF-3的表达进行动态观察，以全面了解TGF-3在TCDD诱导胎鼠腭裂发生中所扮演的角色。1 材料与方法1.1 实验动物810周龄、体重2023 g清洁级C57BL/6J小鼠，购自重庆医科大学实验动物中心许可证号：SCXK（渝）20050002。1.2 主要实验试剂 玉米油（Sigma-Aldrich，USA），TCDD（Sigma-Aldrich，USA）

11、，RNApure高纯总RNA快速抽提试剂盒（离心柱型）（百泰克，中国），逆转录试剂盒（IBM，美国），2×Power Taq PCR MasterMix（百泰克，中国），琼脂糖（TaKaRa, 日本），蛋白提取试剂盒（凯基，中国），蛋白定量试剂盒（百泰克，中国），SDS-PAGE凝胶试剂盒（凯基，中国），PVDF膜（millipore，美国），小鼠TGF-3单克隆抗体（abcam, USA）,抗GAPDH鼠单克隆抗体（康为世纪，中国），山羊抗小鼠IgG（H+L）-HRP二抗（康为世纪，中国），ECL检测试剂盒（凯基，中国）。1.3 动物模型的建立12只孕鼠于GD 10随机分为实验组和

12、对照组，每组6只。实验组予以TCDD 64 µg/kg（用玉米油配制成4 µg/ml)灌胃，对照组予以等量（16 ml/kg）玉米油灌胃。于GD 18.5颈椎脱臼法处死孕鼠，剖腹取出胎鼠，解剖显微镜下观察腭突发育情况，并统计腭裂发生率。1.4 总RNA和总蛋白的提取及定量检测 18只孕鼠于GD 10随机分成实验组和对照组，每组9只，处理方法同上。由于分子表达的时空特异性，提取RNA和蛋白时，根据标本的采集时间不同，每组又分为3个亚组：GD 13.5、GD 14.5、GD 15.5，每个亚组3只孕鼠，在解剖显微镜下剪取腭突组织，按试剂盒操作说明分别提取总RNA和总蛋白，然后用

13、ND100 0分光光度仪测定RNA浓度及OD260OD280值，用BCA法进行蛋白定量。1.5 RT-PCR检测TGF-3 mRNA表达各取2 µg总RNA逆转录合成cDNA，方法参照产品说明书。根据GenBank中公布小鼠TGF-3基因序列，按照引物设计原则设计引物序列如下：TGF-3上游引物：5-GCC CTG GAC ACC AAT TAC TGC TT-3，下游引物：5 -GCA CTT ACA CGA CTT CAC CAC CAT-3，PCR扩增片段长度为333 bp；内参-actin上游引物：5-GAG ACC TTC AAC ACC CCA GC-3，下游引

14、物：5 -CCA CAG GAT TCC ATA CCC AA-3，PCR扩增片段长度为446 bp。所有引物由上海生物工程技术服务公司合成。PCR反应体系为：ddH2O 7.0 µl、2×Power Taq PCR MasterMix (含染料) 10.0 µl、上游引物0.5 µl、下游引物0.5 µl、cDNA 2.0 µl，总体系 20.0 µl。PCR反应条件为：94预变性5 min，94变性30 s, 62退火30 s，72延伸50 s，共30个循环，最后72再次延伸5 min。各取5 µl

15、PCR产物在含EB的1.5%琼脂糖凝胶中电泳，140 V，40 min；然后在紫外凝胶成像仪上成像分析，以特异性扩增产物条带与相应内参条带吸光度比值表示TGF-3mRNA的表达水平。1.6 Western blot检测TGF-3蛋白的表达各取50 µg总蛋白进行10%SDS-PAGE凝胶电泳并转印至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入TGF-3一抗（3 µg/ml）或GAPDH一抗（1:100 0）4孵育过夜，次日加入山羊抗小鼠二抗（1:300 0）室温孵育2 h，ECL化学发光法显色，自动凝胶成像分析仪上成像分析，以TGF-3蛋白条带的积分灰度值与GAPDH的积分

16、灰度值的比值表示TGF-3蛋白的表达水平。1.7 统计学分析采用SPSS 17.0软件进行统计分析，实验结果以均数±标准差(±)表示，两样本间均数比较采用t检验(方差不齐者采用t检验)。 P<0.05，视为差异有统计学意义。2 结果2.1 TCDD诱导胎鼠腭裂模型的建立GD 18.5，两组胎鼠均为活胎，无死胎及胎吸收。实验组6只小鼠孕有39只胎鼠，全部为腭裂。对照组6只小鼠孕有42只胎鼠，无腭裂发生。实验组、对照组胎鼠腭部大体解剖学表现见图1。A为对照组（×20）；B为实验组（×20）图1 GD18.5胎鼠腭部大体解剖学表现（黑色箭头所指为小鼠腭部

17、）2.2 TGF-3 mRNA的表达情况RT-PCR显示，实验组腭突内 TGF-3 mRNA的表达在GD 13.5, GD 14.5和GD 15.5均明显增高，与对照组比较具有显著差异（P<0.05）（图2，表1）。M600bp100bp 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12M：DNA标准（DL600）；16为对照组；712为实验组；13和1012为-actin（446 bp）；49为TGF3（333 bp）；1、4、7、10为GD13.5；2、5、8、11为GD14.5；3、6、9、12为GD15.5图2 RT-PCR检测TGF-3 mRNA在胎鼠腭突中表达表1 实

18、验组和对照组不同时间点TGF-3 mRNA相对内参表达值(n=3，±) GD13.514.515.5对照组0.081±0.0200.178±0.0110.113±0.016实验组0.392±0.056a0.467±0.064b0.192±0.032ca： P<0.05（t=-12.732），b：P<0.05（t=10.854），c：P<0.05（t=5.406），与对照组比较2.3 TGF-3蛋白的表达情况与TGF-3 mRNA表达情况一致，Western blot显示实验组腭突内 TGF-3 蛋白的表达在

19、GD 13.5,GD 14.5和GD 15.5均明显增高，与对照组比较具有显著差异（P<0.05）（图3，表2）。TGF-3（47×103） 1 2 3 4 5 6GAPDH（36×103）13为实验组；46为对照组；1、4为GD13.5；2、5为GD14.5；3、6为GD15.5图3 Western blot 检测TGF-3 蛋白在胎鼠腭突中表达表2 实验组和对照组不同时间点TGF-3蛋白相对内参表达值(n=3，±) GD13.514.515.5对照组0.017±0.0010.039±0.0030.005±0.001实验组0.

20、046±0.009a0.089±0.015b0.028±0.003ca：P<0.05（t=5.678），b：P<0.05（t=5.615），c： P<0.05（t=13.715），与对照组比较3 讨论腭的发育是一个多因素综合作用的过程，包括腭突生长、上抬及融合等步骤。胎鼠GD 10.5左右，球状突和上颌突形成上唇和原腭；GD 12.5GD 13.5，腭板在舌体两侧垂直生长；GD 14.5，腭板上抬至舌体上方水平位置；然后，两侧腭板水平方向继续生长于中线处接触，使腭中嵴上皮细胞（Medial edge epithelial, MEE）暂时呈复层上皮

21、细胞形成腭中线（Midline epithelial seam, MES）3。随后MEE经细胞凋亡、上皮-间充质转化（Epithelial mesenchymal transformation, EMT）及MEE向口腔/鼻腔样上皮转化4-6而消失。GD 15.5，腭板进一步间充质化融合。这一进程中的任何环节发生异常都会导致腭裂的产生。TCDD是毒性最强的环境污染物之一，广泛来源于汽车尾气、化工冶金工业、垃圾焚烧等7。TCDD分布广泛、结构稳定，易于经环境复合物及食物链在生物体内积聚8。尤其是对儿童，TCDD可导致广泛的生理和毒理反应，包括生殖和发育缺陷1，如先天性腭裂和肾积水等。早期研究发现，

22、GD 9.0GD 12.0是二噁英诱导胎鼠腭裂的敏感窗口期9。故，本实验选择在GD 10.0 给药，剂量参照国外文献报道的64 µg/kg10，遂成功诱导出胎鼠腭裂模型，腭裂发生率为100%，无死胎及胎吸收等现象，较李承浩等11用24 µg/kg TCDD诱导胎鼠腭裂55.56%的发生率显著增高。TGF-3为TGF-超家族成员，有广泛的生物学作用，参与调控细胞增殖、EMT及细胞凋亡等12。TGF-3为腭突发育过程中的关键因子，特异性地表达于胎鼠腭突形成关键时期的MEE中13，促进MEE细胞凋亡、EMT及MEE向口腔/鼻腔样上皮转化4-6，进而促进腭突融合；TGF3-/-胎鼠

23、MEE细胞凋亡减少、EMT减弱，导致细胞附着受损、腭板融合不能6，最终形成腭裂。以上研究说明，TGF-3缺乏可导致先天性腭裂的发生。然而，环境污染物TCDD诱导的腭裂组织中TGF-3的表达情况是怎么样的呢？课题组前期研究中发现，TCDD显著上调腭突融合关键点GD 14.5胎鼠腭突组织中TGF-3的表达2。本研究在此基础上更为系统、全面地研究了腭突融合前（GD 13.5）、融合时（GD 14.5）及融合后（GD 15.5）TGF-3的表达情况。结果显示，实验组TGF-3 mRNA和TGF-3蛋白的表达水平在GD 13.5、GD 14.5和GD 15.5均较对照组显著增高，进一步证实了TCDD在腭

24、突融合的各个主要时段显著上调胎鼠腭突组织中TGF-3的表达。并进一步确认，TGF-3过高表达亦可引起腭裂的发生。在本研究中，腭裂组织中TGF-3表达较正常腭突组织明显升高，与课题组前期动物实验2及临床检测14结果一致；但与柴茂洲等18研究结果差异较大。其研究结果是：TGF-3 mRNA的表达在GD 13.5无明显变化，在GD 14.5和GD 15.5明显降低。分析这种差异的可能原因有:所用诱导剂不完全相同。柴等18应用的诱导剂是TCDD和地塞米松联合诱导，而本研究仅用TCDD一种诱导剂。推测，TCDD和地塞米松对TGF-3信号通路的联合作用机制与TCDD单独对TGF-3信号通路的作用机制可能有

25、所不同。所用TCDD剂量不同。柴等15应用TCDD的剂量为3 µg/kg，从GD 10开始连续3天灌胃；而本研究参照国外文献报道方法予TCDD 64 µg/kg于GD 10一次灌胃10。故推测，TGF-3或其信号通路对不同剂量TCDD的反应亦可能不同。本研究进一步证实，TCDD可导致胎鼠腭裂的发生，并可显著上调整个腭突融合过程中腭突组织中TGF-3的表达。TGF-3过高表达可能是TCDD诱发先天性腭裂的主干信号通路之一。但其具体的机制有待进一步研究。参考文献:1 Vorderstrasse BA, Fenton SE, Bohn AA, et al. A novel eff

26、ect of dioxin: exposure during pregenancy severly impairs mammary gland differentiation J. Toxicological Sciences, 2004, 78(2): 248-257.2 Li-qiang GAN,Yue-xian FU,Xing Liu, et al. Transforming Growth Factor-3 Expression Up-regulates on cleft palates induced by 2, 3, 7, 8- tetrachlorodibenzo-p-dioxin

27、 in miceJ. Toxicology and Industrial Health, 2009, 25(7):473-478.3 Ferguson MW. Plate development J. Development, 1988, 103Suppl: 41-60.4 Murillo J, Maldonado E, Barrio MC, et al. Interactions between TGF- beta1 and TGF-beta3 and their role in medial edge epithelium cell death and palatal fusion in

28、vitroJ. Differentiation, 2009, 77(2):209-220.5 Choi KY, Kim HJ, Cho BC, et al. A TGF-beta-induced gene, betaig-h3, is crucial for the apoptotic disappearance of the medial edge epithelium in palate fusion J. J Cell Biochem, 2009, 107(4): 818-825.6 Martínez-Alvarez C, Blanco MJ, Pérez R, et

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