流式细胞术与三种活化血小板检测方法的比较

1、作者单位:361003厦门,福建医科大学附属厦门第一医院检验科(洪强,神经内科(陈汉水临床实验诊断研究流式细胞术与三种活化血小板检测方法的比较洪强陈汉水血小板活化与多种血栓性疾病有关1。血液中活化血小板增高可作为动脉血管病,如脑梗死、心肌梗死,外周血管病等局部血栓形成的标志物2。活化血小板的测定,对于血栓形成的预防、诊断及治疗有着重要的意义。近年来,随着流式细胞仪应用的普及,使得活化血小板的检测成为可能。目前,活化血小板的测定方法主要有传统的血浆法、全血法与较新应用的内固定法。本研究对3种方法的具体操作步骤和方法进行比较,旨在全面评价和筛选最适合于临床实验室日常应用的活化血小板检测方法。一、对

2、象和方法11对象:(1正常组30名(男18名,女12名平均年龄43岁。均为体检合格,抽血前至少两周未用过任何药物的健康者。(2脑梗死组30名(男20名,女10名平均年龄62岁。所有病例均为首诊患者,均经CT和MR I显像证实,诊断时症状、体征已持续5h以上。(3血标本采集在患者入院后,未经任何治疗立即抽取。21试剂:(1抗体:CD62P2F I TC,CD632PE,I gG12F I TC, I gG12PE均购自法国I m munotech公司。(2仪器:EP I CS2XL 型流式细胞仪,美国Coulter公司。31方法:(1标本采集及处理:空腹取血,第一管做其他检查,第二管采集于116

3、m l血于含3%多聚甲醛(PF A和318%枸橼酸钠的负压抗凝管(PF A的终浓度为1%及普通的14枸橼酸钠抗凝管中。(2富血小板血浆(PRP的制备:将抗凝全血以1000r/m in离心5m in,可得PRP。(3内固定法:将上述固定抗凝管中的全血分离出PRP,取200l PRP,用磷酸盐缓冲液(P BS洗涤后,加015m l P BS重悬,取20l标本和10l荧光标记单抗混合室温孵育20m in后,用P BS洗涤一次后,加入015m l P BS重悬,上机分析。(4传统血浆法:将普通14枸橼酸钠抗凝全血分离出PRP,取200l PRP,加入等量2%PF A固定20m in后,洗涤,重悬,标记

4、同内固定法。(5全血法:参考文献3。取普通14枸橼酸钠抗凝全血5l加入10l荧光标记单抗,室温孵育20 m in后,加入1%PF A固定20m in,洗涤一次后,用P BS重悬,上机分析。(6流式细胞仪分析:以Fl owcheck荧光微球检查仪器光路、流路,调整颜色补偿,测定标本。3种方法均用CD41/ssl og散点图设门,流速控制在100200s,每份标本测定500010000个血小板。41统计分析:所有数据 xs表示,采用SPSS1010统计软件进行分析,组间及两两比较采用t检验。二、结果11用3种方法对正常组和脑梗死组,采血半小时内检测血小板C D62p及CD63的表达(表1,2。表1

5、3种方法检测正常组和脑梗死组采血半小时内血小板CD62p的表达(%, xs组别例数内固定法传统血浆法全血法正常组30116001832124112621121129脑梗死组30419121066102213851832115从表1可以看出,3种方法测得的CD62p结果脑梗死组均显著高于正常组(P均0101;组内比较得到,内固定法所得CD62p结果要显著低于传统血浆法和全血法(P均0105。表23种方法检测正常组和脑梗死组采血半小时内血小板C D63的表达(%, xs组别例数内固定法传统血浆法全血法正常组30219211213134116231201129脑梗死组3071692112815131

6、0181333121从表2可以看出,3种方法测得的CD63结果脑梗死组均显著高于正常组(P均0101;组内比较得到,内固定法所得CD63结果要显著低于传统血浆法和全血法(P均0105。2.在血样放置1h及2h后,同样用3种方法对正常组和脑梗死组的活化血小板(CD62p,CD63的表达情况进行检测,结果(表3,4。表3血样放置1h及2h后正常组和脑梗死组活化血小板CD62p的表达情况(%, xs组别例数时间(h内固定法传统血浆法全血法正常组3011169018921871141216311362117601863165116231511159脑梗死组30141962112713231827105

7、3124251082119101625192101035172从表3看,与半小时内CD62p测定结果相比较,内固定法1h及2h的C D62p结果差异均无统计学意义(P 0105,而传统血浆法及全血法随放置时间的延长,测定结果均具有统计学意义(P0105,而传统血浆法及全血法随放置时间的延长,测定结果均有显著性增高,具有统计学意义(P0101。在脑梗死的标本这种差异也更为明显。三、讨论流式细胞术活化血小板检测最早应用的比较成熟的方法是传统血浆法3。后来Shattil报道,采用了全血法进行活化血小板的检测,并以用血量少,避免离心导致人为激活血小板而得到了广泛的应用4,5。内固定法是我们在传统血浆法

8、的基础上,将固定剂多聚甲醛预先加于抗凝管内,在采血时将抗凝和血小板的固定同时进行的一种方法。我们应用上述3种方法,分别对正常组和脑梗死组的血小板活化指标CD62p及CD63的表达情况进行分析。通过前面的比较,我们得出,3种方法均表明脑梗死组活化血小板(C D62p, CD63的表达均显著高于正常组,其与文献报道相一致6。此外,我们还得出,在标本采集的半小时内进行测定,传统血浆法与全血法的活化血小板(C D62p、CD63的测定结果表明,在方法学上两者并无统计学意义。而内固定法所得到的结果显著低于传统血浆法和全血法。在标本放置时间延长后再进行测定,内固定法的所得结果稳定性显著好于传统血浆法和全血

9、法。综上分析,我们认为,内固定法应用含3%PF A及318%的枸橼酸钠抗凝管按14(固定抗凝剂:血液比例采血2m l 后,分离PRP进行活化血小板的测定,由于其以最快的速度对体外血液中的血小板进行固定,最大限度的避免了血小板的体外活化问题,相比于传统血浆法和全血法,它明显降低了因为标本送检、测定不及时以及实验操作等导致的血小板人为活化,是目前最适合临床实验室应用的活化血小板检测方法。参考文献2Ruf A,Patscheke H.Fl ow cyt ometric detecti on of activated p latelets: comparis on of deter m ining s

10、hape change,fibrinogen binding and p2 selectin exp ressi on.Se m in Thr omb He most,1995,21:1462151.4Abra m s C,Shattil SJ.I m munol ogical detecti on of activati on p latelets in clinical dis order.Thr omb Hae most,1991,65:6472650.6尚明谦,郭述苏,陈同慧,等.脑梗死患者血小板膜糖蛋白CD41, CD62P,CD63的监测.中风与神经疾病杂志,1997,14:112

11、13.(收稿日期:2005205228(本文编辑:袁桂清医学新闻临床化学检验试剂自主创新暨国产化研讨会在北京召开由中国科学院中生北控生物科技股份有限公司主办的“临床化学检验试剂自主创新暨国产化研讨会”2005年12月26日在人民大会堂召开。全国人大副委员长、中国科学院长甬祥院士,国家科技部部长徐冠华院士致贺信;国家食品药品监督管理局张敬礼副局长,国家卫生部科教司祁国明司长,中国科学院生命科学与生物技术局局长康乐教授,北京银行许宁跃副行长,国家发展改革委员会宏观经济研究院史清琪研究员,中国科学院生物物理研究所所长、中生北控生物科技股份有限公司董事长铙子和院士,中生北控生物科技股份有限公司吴乐斌总裁等出席会议并作演讲。自主创新是科学的灵魂,自主创新是企业的生命,