正交实验优选补阳还五合剂的提取工艺

1、正交实验优选补阳还五合剂的提取工艺        【摘要】  目的建立补阳还五合剂的提取工艺。方法采用正交实验的方法，以黄芪甲苷苯甲酰化后产物含量、水提得率和正丁醇萃取部位得率为指标，综合考察每次加水量、总煎煮时间、煎煮次数对提取效果的影响。结果加水8倍/次，共煮2 h， 2次提取为最佳提取工艺，验证实验证明了其优于正交各方法。结论 该优选出的提取工艺合理。 【关键词】  补阳还五合剂 正交实验 黄芪甲苷Abstract：ObjectiveTo establish an optimal extr

2、action process for the mixture of Buyang Huanwu. MethodsThe content of Astragalus RP, extractive rate of water and extractive rate of n-butyl alcohol were used as indexes, and orthogonal design was performed to optimize the extraction process. ResultsThe best extraction process was A2B2C2(A：adding w

3、ater volume; B：decocting time C：decocting frequency), and it is the best method by validating. ConclusionThe method is reasonable.Key words： Buyang Huanwu mixture ;   Orthogonal design;   Astragalus RP   补阳还五合剂由黄芪、当归等中药组成，是经典名方制剂，具有补气、活血、通络的功能。本工艺采用L9（34）正交表安排实验，以黄芪甲苷衍生

4、化产物的含量、水提取得率和正丁醇萃取部位得率为指标，综合考察了每次加水量、总煎煮时间、提取次数3个因素对提取效果的影响，优选出该合剂的提取工艺。1  仪器与试剂高效液相色谱仪，agilent1100，四元泵（G1311A），柱温箱（G1316A），VWD检测器（G1314A），工作站（Chemsstation），agilent手动进样器（10 l定量环）。101-1型电热鼓风干燥箱(南通扈通制药器械设备厂)；标准品，黄芪甲苷（Astragalus RP  0781-9706）药品生物制品检定所提供。所用药材均购于江苏省药材公司，并由江苏省中制剂实验室专家鉴定。 吡啶、正丁醇

5、、氢氧化钠、四氢呋喃、苯甲酰氯、三乙胺均购于南京化学试剂一厂，均为分析纯，甲醇为色谱纯。标准品贮备液：精密称取黄芪甲苷标准品7.04 mg，加吡啶溶解定容于10 ml容量瓶中，标准品溶液浓度为0.704 mg/ml，备用。2  方法与结果2.1   相关条件称取黄芪甲苷适量，置容量瓶中，吡啶溶解定容后精密吸取1 ml置容量瓶中，加入2 ml氯仿，吡啶-氯仿（12，V /V），在冰水浴的条件下加入苯甲酰氯0.4 ml。摇匀后置4冰箱中保存24 h，使反应完全。取出置蒸发皿中，在一定条件下挥干有机溶剂，置空气中一段时间后能凝结，甲醇溶解定容于容量瓶中。2.2 

6、; 正交实验正交实验的设计方案 选用正交实验表L9（34），因素设计见表1。3因素分别为：加水倍数、总提取时间、提取次数。3因素3水平共做9组实验。表1  因素水平（略）2.3  水提取得率精密吸取各样品溶液适量，相当于1 g药材量，水浴浓缩至浸膏。取出，置105烘箱中5 h，取出，放冷称量，半小时后再置烘箱中1 h，取出，放冷，称量。2.4  正丁醇萃取部位得率 取相当与1 g药材的各样品水提液与分液漏斗中加10 ml水饱和的正丁醇萃取，共4次，正丁醇层合并。正丁醇层水浴蒸干，然后置105烘箱5 h后取出，放冷，称量，30 min后再置烘箱中

7、1 h，取出，放冷，称量。2.5  标准曲线制备精密吸取对照品贮备液1 ml于10ml容量瓶中，处理参照“衍生化反应条件”项下进行衍生化。衍生化产物用甲醇洗涤并转移、定容于10 ml容量瓶中，再依次精密吸取5ml定容于10 ml容量瓶，对照品衍生化产物溶液浓度为：0.070 4，0.035 2，0.017 6，0.008 8，0.004 4，0.002 2，0.001 1 mg/ml，上述色谱条件进行HPLC测定。以黄芪甲苷衍生物峰面积对黄芪甲苷浓度（mg/ml）直线回归，结果表明，黄芪甲苷在0.001 10.070 4 mg/ml范围内线性关系良好，回归方程为Y=75 117X，r

8、=0.999 95。2.6  样品处理同取各样品20 ml于分液漏斗中，加水饱和的正丁醇萃取，萃取3次，20 ml/次，正丁醇层合并加1%NaOH洗涤，洗涤3次12 ml/次，再加正丁醇饱和水洗涤，洗涤2次，6 ml/次。正丁醇层水浴蒸干，吡啶溶解定容于5 ml容量瓶中，精密吸取1 ml置容量瓶中，加入2 ml氯仿，在冰浴的条件下加入苯甲酰氯0.4 ml。摇匀后置4冰箱中保存24 h消失，使反应完全。取出置蒸发皿中挥干有机溶剂，甲醇定容于容量瓶中，即为样品溶液。1         2.7  黄芪

9、甲苷衍生物含量测定 按“色谱条件”项下操作，结果见表2。表2  正交实验结果（略）2.8  方差分析结果见表3。经过权衡，黄芪甲苷衍生物含量是主要指标，水提取得率和正丁醇萃取得率为次要指标，设黄芪甲苷权重Y=0.7，正丁醇萃取得率权重Y=0.2，水提取得率Y=0.1，（综合得分=衍生物含量得分×70%+正丁醇萃取部位得率得分×20%+水提取得率得分×10%）。方差分析表和正交实验结果可以看出，3个因素对结果的影响都不显著。因素C相对其他因素影响较大，各因素影响次序为CAB；各因素不同水平的影响次序为A3A2A1，B2B3B1，C3C2C1，理论

10、最佳提取工艺为A3B2C3，即煎煮3次，加水10倍/次，共煎煮2 h。考虑到从实验操作的简便性和节省能源和时间角度出发，确定的实际最佳工艺为：加水8倍/次，共煎煮2 h，煎煮2次。表3  方差分析（略）2.9  验证实验按最佳提取工艺煎煮与正交实验等量等比例药材，所得煎液按前法处理、测定，得出黄芪甲苷的含量为0.467，高于正交表中各号实验得率。3  讨论2005版药典黄芪甲苷的含量测定是通过甲醇提取，大孔吸附树脂富集，蒸发光散射检测器检测，目前测定多用此法25。黄芪中含有多种皂苷、氨基酸、多糖和黄酮类成分，这些大多在200 nm左右有吸收的成分对测量的干扰，因而

11、选择蒸发光散射检测器检测。但蒸发光散射法灵敏度较低，而黄芪中黄芪甲苷含量又较低（药典规定不得低于0.004%），用大孔树脂法来提高黄芪甲苷相对含量的方法，富集过程麻烦，误差大。用紫外检测法灵敏度高，但在选用末端波长进行测定干扰很大。曾尝试用紫外检测器检测黄芪甲苷，吸收波长为203 nm左右，流动相为乙腈-水（比例3367；3268；3070；2872不等），用等度洗脱，发现甲醇溶剂和杂质干扰较大，极性相对黄芪甲苷峰与溶剂峰重合，且回不了基线，在改变流动相比例提高流动相极性情况下可分离出黄芪甲苷峰，但理论塔板数低，尽管也有多篇报道此法可行，但未能重复；在梯度洗脱情况下，选择合理的梯度可以将黄芪甲

12、苷和其他杂质分开，且理论塔板数高，但分离度不好（<1.5），这对定量测定带来了误差，所以也未能建立方法进行测定。如何排除杂质的干扰，提高黄芪甲苷的吸收值是解决问题的关键，姚美村等1将黄芪甲苷苯甲酰化后，在230 nm下检测干扰少，吸收值高。依照此方法，取得了满意的结果。流动相中水对保留时间影响非常大，配制时应注意精密吸取，减小误差。黄芪中黄芪甲苷含量相对较低，药典规定含量应不低于0.004%，所以增加了正丁醇萃取部位得率和水提取得率作为指标，3个指标综合考察3个因素对提取效果的影响。提取只是制备工艺的一个过程，制剂的制备还包括浓缩精制等过程，每个过程都是相互关系影响的，所以提取工艺的研究在保证了有效指标成分最大程度的提取出的基础上还要考虑到其他的一系列过程。本实验只研究了补阳还五合剂制备提取工艺，其它过程工艺还有待进一步研究。【文献】  1姚美村，齐 莹.柱前衍生化法测定黄芪中黄芪甲苷的