氨对脑细胞胞浆游离钙含量的影响

1、    氨对脑细胞胞浆游离钙含量的影响          摘要 目的与方法：采用 Fura-2AM探针技术观察 NH4Cl对离体急性分离之Wist ar乳鼠大脑细胞胞浆游离钙Ca2+i含量的影响。结果：NH4 +浓度为25 mmol/L时脑细胞内Ca2+i含量升高。在一定范围内，随着NH4 +浓度的加大，细胞内Ca2+持续升高。NH4+的升钙作用主要被Nicardipine所阻断 ，其变化特征类以KCl。结论：NH4+主要通过影响电压依赖性钙离子通 道的开启而导致细

2、胞内钙稳态失调。氨中毒时所引起的各种脑的功能，代谢及结构改变有可 能通过细胞内钙稳态失调机制实现。关键词：氨；钙离子；脑细胞中分类号：R338.2文献标识码：A 文章编号：1000-6834(2000)02-0114-03THE EFFECT OF AMMONIA ON THE FREE CALCIUM CONTENT OF ISOLATED BRAIN CELLSLI Xia-qing, HAN De-wu, ZHAO Yuan-chang(Department ot Pathophysiology, Shanxi Medical University, Ta iyuan 030001)AB

3、STRACTAim and methods: The effect of ammonium chloride on the free calcium Ca2+i content of isolated brain cell from newborn Wistar rats(2-5 d) were investigated by Fura-2/AM probe techniques in SHIMADZU RF-5000 Spectrof Iuorophotometer (Japan).Results: The Ca2+i, content in 2 .5 mmol/L of ammonium-

4、treated cells was increased. The cytoplasmic Ca2+ i content raised continuously following the increase of ammonium concentrati on. The effect of NH4+ could be blocked by Nicardipine, a kind of blocker fo r voltage-gated calcium channel, which was similar to that ot KCI.Conclus ion: NH4+ might result

5、 in the calcium homeostasis imbalance of brain c ells through interfering the voltage-gated calcium channels. Variable dysfuncti on,metabolic alteration and structural abnormality in ammonia intoxication happe ned in acute or chronic hepatic dieases might be related to the intracelluar cal cium home

6、ostasis imbalance caused by hyperammonemia.KEY WORDS： ammonia;calcium ions；brain cell近年来，人们开始从事细胞内钙稳态失调与细胞代谢、功能及结构变化之间关系的研究，以探讨某些疾病的发病机制1,2。钙有多种生物学功能，钙作为第二信使参 与细胞结构的稳定、电传导、酶及细胞内蛋白质的协调等多种生理过程。在神经系统，钙离 子是最重要的调节神经元结构和功能的离子。高氨状态下脑组织存在着多种代谢紊乱，神经系统的多种功能受到累及，所以。在各种严重 肝病或先天性尿素代谢紊乱引起高氨血症，时常合并脑病的发生。然而，在高氨时，是否

7、脑 细胞内钙离子的分布亦有改变目前尚不清楚。为此，本文采用体外实验方法观察氨对脑细胞 胞浆游离钙含量的影响，旨在为探讨肝性脑病的发病机制提供依据。1材料与方法11动物及试剂动物采用生后35 d Wistar乳鼠。Fura-2AM钙离子荧光探针(中国医学科学院北京药物 研究所)；DMEM培养基（Gibco公司)；胰蛋白酶（Sigma公司）；牛血清白蛋白（Fluka 公司）；其余试剂皆为市售国产分析纯。1.2脑细胞悬液制备3将脑组织置于冰冷D-Hanks液(mmol/L) NaCl 137,Na2HPO40.6,KH2PO40.4,NaHCO 33.0,Glucose 5.6,Hepes 20,p

8、H 7.4。去除小脑及脑干，小心剥去表面脑膜及血管，剪碎 ，加入适量0.25%胰酶液（Sigma)产品，消化10min(37）。用含0.2%小牛血清白蛋白 （BSA）的冰冷DMEM终止消化，分散细胞，滤过，制备细胞悬液。苔盼蓝染色95 以上为存活细胞时方可用于实验。1.3Fura-2/AM负载及荧光测定上述细胞悬液37预温5 min,加入Fura-2/AM,终浓度：5 mol/L,37水浴恒温振荡 40 min进行负载。负载后，调整细胞浓度为12×106/ml，在岛津（日本）RF-5 000双波长荧光分光光度计上进行测定。测定条件：激发光栅5 nm，发射光栅10 nm，以340 nm

9、和380 nm波长激发，480 nm波长发射测定时依次记录静息状态（细胞外钙浓度为13 mmolL)及加入不同浓度 N H4Cl后的340380 nm的荧光比值(R)，根据下列公式求出细胞内游离钙Ca2+ i的含量。Ca2+ikd(F0/FS)(R-Rmin)/(Rmax-R)公式中，kd224 nmol/L;Rmax和 Rmin分别为最大值和最小值；Fo和 FS分别代表Ca2+为零和 Ca2+饱和状态下，在380 nm波长测得的荧光强度。 14实验分组(1)加入 NH4Cl组：NH4+的终浓度(mmol/L)依次为25,5及10。(2)加受体门控性钙离子通道阻断剂MgCl24作用5 min后

10、再加 NH4Cl组： MgCl2终浓度为400 mol/L。(3)加电压依赖性钙离子通道阻断剂Nicardipine作用5 min再加 NH42结果2.1NH4+对静息状态下脑细胞内游离钙含量的影响加入25 mmol/L NH4+10 s后，脑细胞内游离钙含量明显增加。增加NH4+的 浓度，其胞浆内游离钙含量呈递增趋势：当NH4+浓度达到10 mmol/L时，细胞内游离钙 含量增至最高值(1)。继续增加NH4+的浓度，游离钙含量不再增加。     Fig.1 Effect of NH4 on the cytoplasm icCa2+i content o

11、f isolated brain cells*P<0.05, vs NH4 0(nmol/L)22钙离子通道阻断剂对NH4+升钙作用的影响用受体门控性钙离子通道阻断剂MgCl2和电压依赖性钙离子通道阻断剂Nicardiipine 分别阻断钙离子通道，再向悬液中加入不同浓度的NH4+。NH4+的升钙作用基本不 受 MgCl2影响。MgCl2阻断后,NH4+可使细胞内游离钙升高的百分比有所下降，但与单纯加NH4+组相比其差异无统计学意义（2)。Nicardipine阻断后，NH4+升高细 胞内游离钙的百分率明显下降，与未阻断前相比，差异具有显著性(P005)。NH4 +升高脑细胞内游离钙的作

12、用主要被Nicardipine所阻断(2)。NH4+的这种被阻断观 象类似于电压依赖性钙离子通道阻断剂-KCl，在同样浓度的Nicardipine作用下，KCl的升 钙作用几乎可被完全阻断(表1)。     Fig.2 Blockage effect of MgCl2 and N icardipine on NH4Cl 3讨论本文的实验结果表明，将NH4Cl加入细胞悬浮液造成高氨环境时，脑细胞内游 离钙含量明显升高,NH4+浓度为10 mmolL时，细胞内钙浓度升至最高值。Tab.1 Block effect of Nicardipi ne on the

13、 C a2+iKCl(mmol/L)0255075Before blockage 1343±1441533±1561773±153*1773±153 *After blockgage140.4±17.11458±18.51459±1651502 ±97     *P<0.05,vs KCl 0 and 25(mmol/L) 生理条件下，氨(NH3)在体循环内主要以氨离子(NH4+)的形式存在(NH3+H +NH4+)5。因此,氯化铵和醋酸铵经常被用于体内外实验中研究氨对

14、机体的 影响。Szerb等认为5，NH4+之所以能够引起细胞内游离钙浓度升高可能是由 于NH4+具有K+样性质，可与K+竞争进入细胞，使细胞内Ki+降低，引起脑细胞 不同程度的去极化，从而导致电压依赖性钙离子通道开放，大量的Ca2+进入细胞内， 细胞内Ca2+浓度升高6。当用Nicardipine阻断后，氨的这种升钙作用被 阻断，本实验观象也证实了上述论点。据文献报道，在实验性门腔分流性肝性脑病动物及各种肝病所引起的肝性脑病病人，脑内氨的浓度可达到25 mmol/L5。故本实验所选择的NH4+浓度主要依据上述 而确定。在25 mmolLNH4+浓度内，脑细胞内Ca2+i含量确实表现升高 。普遍

15、认为，肝性脑病属代谢性脑病范畴，脑病发作期间神经细胞没有明显的结构损伤，脑内的特征性改变是神经细胞的多种功能及代谢的紊乱，如神经传递功能障碍及神经递质种类改变等。已有文献报道，在急性肝功能衰竭及急性实验性高氨血症时可发生脑细胞水肿。许多临床与实验结果证实，这些功能代谢紊乱主要与氨中毒有关，但氨中毒同时，是否脑细胞内钙的稳态也发生变化则尚有争议。Benjamin等人7通过对大鼠脑片的研究发 观，一定程度的钙离子浓度升高可以促进胶质细胞对氨的解毒代谢增强，而当钙的浓度过大 时则产生相反的作用。另外，还有人认为，钙离子参与细胞体积大小的调节8。 细胞内钙稳态失调可能损伤细胞体积稳定性调节机制，导致细

16、胞水肿甚至凋亡。已有研究者 发现，高氨血症可引起脑胶质细胞肿胀9。是否这种肿胀为钙稳态失调所致尚需 进一步澄清。通过本实验所得结果可以认为，高氨环境下细胞内游离钙含量确有改变，氨中毒时所引起的各种功能，代谢及结构改变有可能通过细胞内钙稳态失调机制实现。作者简介：李夏青（1958-），女，河北省人，副教授，博士，从事 慢性实验肝功能不全的发病机理及肝性脑病发生机制的研究李夏青(山西医科大学病理生理教研室，太原030001)韩德五(山西医科大学病理生理教研室，太原030001)赵元昌(山西医科大学病理生理教研室，太原030001)参考文献1 Farber J L. The role of calc

17、ium in cell deathJ. Life S ci,1981,29:1289-1292.2 Sanchez-Prieto J, Goncalez P. Occurrence of a large Ca2+- independ ent release of glutamate during anoxia inisolated nerve terminals (synaptosome s)J. JNeurochem,1988,50:1322-1324.3 Didly J E, Leslie S W. Ethanol inhibits NMDA-induced increase in fre

18、e int racellular Ca2+ in dissociated brain cellsJ Brain Res,1989,499: 383-391.4 高红，冯亦璞.用Fura-2测定突触体内游离Ca2+浓度及Ca2+通道 激动剂和阻断剂的影响J.药学学报，1993，28（6）：404-409.5 Szerb J C, Butterworth RF. Effect of ammonium ions on synaptic transmissio n in the mammalian central nervous systemJ. Prog Neurobiol, 1992,39:135 -153.6 Nicoll R A. The blockage of G