水稻光温敏核不育系的ISSR和SSR遗传分析比较_图文

1、研究报告RESEARCH REPOR T水稻光温敏核不育系的ISSR 和SSR 遗传分析比较李进波2,3江良荣3李春海1牟同敏131华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室, 武汉, 4300702湖北省农科院杂交水稻工程技术研究中心, 武汉, 4300703海南省农作物分子育种重点实验室, 三亚, 5720253通讯作者, tongmin public. wh. hb. cn 推荐人, 方宣钧摘要本研究应用ISSR 和SSR 技术建立了24个水稻光温敏核不育系的DNA 指纹图谱, 利用13个ISSR 引物和20对SSR 引物, 分别获得174个多态性片段和62个多态性片段, 平均每个ISSR

2、引物检测到13138个多态性片段, 远远高于SSR 引物的检测率。根据遗传距离进行的聚类分析表明, 利用这两种标记所得的聚类结果十分相似, 24个材料被聚为粳型, 偏籼型和籼型三个类群, 在籼型不育系类群内, 又可明显的分成三个亚类群, 其中7个安农S -1衍生的不育系聚为一类, 与农垦58S 衍生的不育系有明显的遗传差异。根据两种标记计算的遗传距离及其遗传关系, 所得的结果仍有一些差异, 但总体趋势是一致。研究结果表明, ISSR 和SSR 标记适用于构建DNA 指纹图谱, 进行分类鉴定和遗传分析。关键词水稻, 光温敏核不育系, ISSR , SSR , 遗传分析Comparisons of

3、 G enetic Analysis Based on ISSR and SSR in P GMS and TGMS Rice LinesLi Jinbo 2,3Jiang Liangrong 3Li Chunhai 1Mou tongmin 131National K ey Laboratory of Crop G enetic Improvement , Huazhong Agricultural University , Wuhan , 4300702Hybrid Rice Research and Development Center , Hubei Academy of Agricu

4、ltural Sciences , Wuhan , 4300703Hainan Provincial K ey Laboratory of Crop Molecular Breeding , Sanya , 5720253Corresponding author , tongmin public. wh. hb. cnCommunicated by Fang X. J.ABSTRACTIn this study , DNA fingerprints of 24elite photoperiod 2sensitive genic male sterile (P GMS and thermo 2s

5、ensitive genic male sterile (TGMS rice lines were established using inter 2simple sequence repeats (ISSR markers and simple sequence repeats (SSR markers. 13ISSR primers could amplify 174polymorphic bands and 20SSR primers could amplify 62polymorphic bands. The numbers of average polymorphic bands p

6、roduced by per ISSR primer are 13138more than those produced by per pair of SSR primer. The results showed that分子植物育种,2003年, 第1卷, 第1期, 第4247页clustering analysis based on ISSR data is very similar to that based on SSR data. These 24sterile lines used in this research were divided into three groups ,

7、i ndica group , i ndica 2like and japonica group. In the i ndicagroup , 19sterile lines were also clustered into t hree sub groups. 7sterile lines derived f rom A nnon g S 21were clustered toget her , w hich show obviousl y genetic diff erences com pared to 11i ndica sterile lines derived fromNongke

8、n 58S. There are a little differences in genetic distance and genetic relationship of tested sterile lines cal 2culated by depending on data from ISSR or SSR. The results of this research demonstrated that it is more suit 2able for using ISSR and SSR as marker to do DNA fingerprint construction , cl

9、assification and genetic analysis.KEY WORDSRice , P GMS , TGMS , ISSR , SSR , G enetic analysis1前言两系法培育杂交水稻是利用亚种间杂种优势的主要育种途径之一。自从1979年石明松发现湖北光敏感核不育水稻农垦58S , 人们陆续发现了许多新的水稻光、温敏核不育资源, 如安农S 21, 5460S 等, 并以这些原始不育材料为不育基因供体, 育成了各种不同类型的光、温敏核不育系, 配制的两系杂交稻组合已在全国大面积推广应用。目前, 全国已有30多个组合通过了省级和地市级品种审定委员会审定, 其中广亲和不

10、育系培矮64S 组配的两系籼爪交组合培杂特青、培杂山青、两优培九等已在生产上大面积使用, 实现了亚种间杂种优势的部分利用(卢兴桂等, 2001 。目前国内应用于生产的光、温敏核不育系主要是来自于光敏感核不育水稻农垦58S 和温敏感核不育水稻安农S 的衍生系, 这些不育系不仅在籼粳类型上和光温敏特性上有差异, 而且在农艺性状的表现上也千差万别。尤其是以农垦58S 为不育基因供体, 在各种籼稻和粳稻材料中经过广泛转育, 使得它们具有丰富的遗传背景, 相互之间的亲缘关系更为复杂, 很难从形态上和系谱来源上对他们进行分类研究和遗传分析。本研究采用的ISSR (inter 2simple sequenc

11、e re 2peats 和SSR (simple sequence repeats 标记技术, 都是基于PCR (polymerase chain reaction 技术的DNA 分子标记技术, 前者采用1722碱基的重复锚定引物扩增重复序列之间的片段, 后者通过事先设计出成对的特异引物来扩增重复序列单元。它们具有重复性好、稳定程度高、多态性丰富等优点, 已被广泛用于品种鉴定、遗传多样性分析、遗传作图等研究(Zietkiewicz et al. ,1994; 方宣钧等, 2001; Akagi et al. , 1997 。利用这两种标记对水稻进行遗传分析和分类研究已有不少报道, 如利用ISS

12、R 标记研究栽培稻和野生稻的亲缘关系(何予卿等, 2001 , 分析中国疣粒野生稻的遗传多样性(钱韦等, 2000 , 对水稻光温敏核不育系进行分子鉴定和遗传分析(李进波等, 2002 , 利用SSR 标记对两系杂交稻的不育系和恢复系进行分类研究(朱作峰, 2001 , 对杂交稻主要亲本进行遗传差异研究(李云海等, 1999; 段世华, 2002 , 但同时利用这两种标记对水稻光温敏核不育系的遗传关系进行系统性比较研究, 目前尚未见报道。本研究从已通过省级以上鉴定的不育系和近几年参加全国不育系联合鉴定的不育系中, 选取有代表性的17份来源农垦58S 和7份来源安农S 21的不育系, 共24份材

13、料为研究对象, 应用ISSR 和SSR 两种标记技术对它们进行研究, 旨在探讨ISSR 和SSR 标记建立DNA 指纹图谱的可行性, 比较对水稻光、温敏核不育系的遗传多样性分析和分类鉴定的实用性, 为不育系的选育和杂交组合的亲本选配及育种家知识产权的保护提供分子依据。2材料与方法211试验材料供试的24个不育系(表1 , 均由育成单位提供。试验所用的生化试剂、酶及缓冲液购自Promega 公司。ISSR 引物购自加拿大British Columbia 大学。水稻SSR 引物根据http :/wanyu 2song. cn. hongnet. com/download/mblab/ricessr

14、. pdf 查得, 由上海生工合成。水稻光温敏核不育系的ISSR 和SSR 遗传分析比较Comparisons of G enetic Analysis Based on ISSR and SSR in PGMS and TGMS Rice Lines43表1供试的24个不育系材料Table 124sterile lines used in the study 编号code 不育系名称names of sterile lines不育基因来源origin of sterile gene籼粳类型indica or japonica type光温敏特性PGMS or TGMS育成单位release

15、of origin1农垦58S农垦58S 粳光敏湖北仙桃农科所27001S 农垦58S 粳光敏安徽农科院3N5088S农垦58S 粳光敏湖北农科院4培矮64S农垦58S 偏籼温敏湖南杂优中心5HN5S 农垦58S 偏籼温敏湖北农学院6K1405S 农垦58S 籼温敏广西农科院7N17S 农垦58S 籼光敏华南农业大学8W6111S 农垦58S 籼温敏湖北农科院9W7415S 农垦58S 籼光敏湖北农科院10W9593S 农垦58S 籼光敏湖北农科院11N23S 农垦58S 籼光敏华南农业大学12N9S农垦58S 籼光敏华南农业大学13苏紫S农垦58S 籼温敏扬州大学农学院14G D 2IS农垦

16、58S 籼温敏广东农科院15中紫S农垦58S 籼温敏中国水稻所16G D 22S农垦58S 籼温敏广东农科院17蜀光612S农垦58S 籼温敏四川农业大学18F131S 安农S 21籼温敏江西赣州水稻所197075S安农S 21籼温敏江西农科院20安湘S 安农S 21籼温敏湖南杂优中心21香125S 安农S 21籼温敏湖南杂优中心22湘早22S安农S 21籼温敏湖南杂优中心23810S 安农S 21籼温敏湖南安江农校241290S安农S 21籼温敏江西农科院212基因组DNA 的提取将水稻种子浸种、催芽后种于培养钵中, 一周后剪取幼苗叶片, 按修改后的CTAB 法提取基因组DNA (方宣钧等,

17、 1997 。213PCR 扩增和电泳检测ISSR -PCR 反应体系和扩增程序同文献(李进波等, 2002 , SSR -PCR 反应体系和扩增程序以及聚丙烯酰胺凝胶电泳和快速银染检测参照文献(李进波等, 2002 进行。PCR 反应在美国MJ Research , Inc. 生产的PTC 2100TMPCR 仪中进行。214数据统计分析将ISSR 和SSR 扩增产物片段, 分别用1和0记录DNA 片段的有无, 利用CL UST 分析软件, 计算遗传距离D (D =-ln2M xy /(M x +M y ,M x 和M y 分别为X 和Y 两材料的总片段数, M xy 为共享片段数 , 用U

18、 P GMA 法进行聚类分析, 绘制树形图。3结果与讨论311ISSR 和SSR 指纹图谱的建立利用筛选到的13个ISSR 引物和20对SSR 引物分别对供试材料进行PCR 扩增, 建立了相应的DNA 指纹图谱(图1、图2 。从表2中可以看出,44分子植物育种Molecular Plant BreedingISSR 能揭示DNA 多态性的水平远远高于SSR 。通过指纹图谱比较发现, 无论是ISSR 指纹图谱还是SSR 指纹图谱, 任何两个不育系间都没有完全相同的带型, 通过比较DNA 指纹能将供试的24个不育系一一区分 。表2ISSR 2PCR 和SSR 2PCR 的扩增结果比较Table 2

19、Comparison of the results amplified by ISSR and SSR 项目itemsISSRSSR引物数量number of primers1320多态性片段总数polymorphic fragments17462平均每个(对 引物的多态性片段数polymorphic fragments per primer131383110片段大小(bp size of fragment200-300085-262图1ISSR 引物UBC890的扩增结果例子Figure 1The examples of banding patterns amplified by ISSR

20、Primer UBC 890图2SSR 引物RM125(上 和RM286(下 的扩增结果例子Figure 2The examples of banding patterns amplified by SSR primers RM125(above and RM286(below 312水稻光、温敏核不育系的ISSR 和SSR遗传分析根据遗传距离进行聚类分析, 从绘制的树形图(图3、图4 可看出, 利用这两种标记得到的聚类分析结果十分相似。供试的24份材料可明显地分成粳、偏籼、籼三个类群, 在籼稻类群内, 又分为三个亚类群, 其中7个安农S 21衍生的不育系自聚为一类, 可与农垦58S 衍生的不

21、育系加以区分。遗传分析结果表明, 籼粳类型上存在的遗传差异表现出亲缘关系的差异是最主要的。在籼型不育系类群中, 不育基因来源不同也表现出明显的遗传差异, 安农S 21衍生的籼型不育系与农垦58S 衍生的籼型不育系各自形成不同的亚类群。安农S 21衍生的籼型不育系相互之间遗传差异相对较小, 这与安农S 21主要在早籼稻中进行转育水稻光温敏核不育系的ISSR 和SSR 遗传分析比较Comparisons of G enetic Analysis Based on ISSR and SSR in PGMS and TGMS Rice Lines45有关; 而农垦58S 衍生的籼型不育系, 具有更丰富

22、的遗传多样性, 可能这与农垦58S 由粳型经籼粳杂交转育成籼型不育系时, 所用亲本范围较广密切相关。这也正是以农垦58S 衍生的不育系配制的杂交组合在我国已经投入商品化种子生产的两系杂交稻组合中占绝大多数的主要原因 。图324个不育系ISSR 标记的U PGMA 树形图Figuer 3Dendrogram of 24sterile lines based on ISSR data using U PGMA method and Nei distance图424个不育系SSR 标记的U PGMA 树形图Figure 4Dendrogram of 24sterile lines based on

23、SSR data using U PGMA method and Nei s distance313ISSR 和SSR 用于分析水稻光温敏核不育系遗传差异的比较应用ISSR 和SSR 两种标记所获得的结果, 总体上是一致的, 但在具体的遗传距离和少数不育系的遗传关系上略有差异。在SSR 分析中, 籼粳两大类群之间以遗传距离014947为分界线, 24个不育系之间的遗传距离在010213-019163之间, 而在ISSR 分析中, 籼粳两大类群之间以遗传距离015618为分界线, 24个不育系之间的遗传距离在010256-111757之间。蜀光612S 在ISSR 分析中与K1405S 、N17

24、S 、W6111S 、N23S 和中紫S 聚为一类, 而在SSR 分析中介于籼型类群与偏籼型类群之间。对于粳型不育系7001S 和N5088S , 都是以农垦58S 为母本, 以中粳品种为父本, 经一次杂交多代选育而成, 用ISSR 分析时, 7001S 与农垦58S 之间的遗传距离大于N5088S 与农垦58S 之间的遗传距离, 而用SSR 分析时, N5088S与农垦58S 之间遗传距离大于7001S 与农垦58S之间遗传距离。产生这些差别的主要原因可能有两方面:一是ISSR 标记和SSR 标记所检测的基因座位不同, 因为SSR 标记检测的是重复序列, 而ISSR 标记检测到的是重复序列间

25、片段; 二是与所选择的引物有关, 因为不同的引物检测到的多态性是不一样的, 而且多态性片段数随引物数量的增加而增加, 必然引起遗传距离的变化。ISSR 和SSR 标记是基于PCR 技术的DNA 分子标记, 与RFL P 、AFL P 等分子标记相比, 省去了酶切、放射自显影等繁琐过程, 操作相对简单, 对DNA 质量和数量的要求也较低。ISSR 标记结合了RAPD 和SSR 标记的优点, 使用比RAPD 引物更长的引物, 克服了RAPD 标记稳定性和重复性差等缺点; SSR 标记虽然在引物开发阶段需投入大量人力、财力, 但引物开发一旦成功, 只需利用商品化的SSR 引物进行PCR 扩增, 即可

26、获得丰富的DNA 多态性。本研究应用ISSR 和SSR 标记对水稻光温敏核不育系进行的遗传分析结果基本相同, 不仅能揭示供试材料籼、粳亚种之间的46分子植物育种Molecular Plant Breeding水稻光温敏核不育系的 ISSR 和 SSR 遗传分析比较 47 Comparisons of Genetic Analysis Based on ISSR and SSR in P GMS and T GMS Rice Lines 遗传差异 , 而且能检测出偏籼型不育系与其它不 育系之间的遗传差异 , 在籼型不育系中 , 还能根 据不育基因来源的不同确定各材料之间的亲缘关 系 。两种分子标

27、记比较而言 , 由于 ISSR 标记能检 测出更多的 DNA 多态性 , 而且一套 ISSR 引物可 在多种作物中通用 , 提高了其利用率 , 因此在遗 传关系研究方面 , ISSR 标记具有更广阔的应用前 景。 段世华 , 毛加宁 , 朱英国 , 用微卫星 DNA 标记对我国杂交 水稻主 要 恢 复 系 遗 传 差 异 得 检 测 分 析 , 遗 传 学 报 , 2002 , 29 ( 3 , 250 - 254 DNA 应用于 RAPD2PCR 扩增 , 高技术通讯 , 1997 , 7 ( 10 , 40 - 43 ISSR 分子标记研究栽培稻和野生稻亲缘关系 , 农业生 ISSR 标记

28、鉴定及遗传分析 , 中国农学通报 , 2002 , 18 ( 1 , 6 - 9 ( 7 , 741 - 750 方宣 钧 , 孔 巍 , 金 芜 军 , 快 速 一 步 法 ( ROSE 法 提 取 方宣钧 , 吴为人 , 唐纪良 , 作物 DNA 标记辅助育种 , 科 学出版社 , 2001 何予 卿 , 张宇 , 孙梅 , 何光存 , 王 松 文 , 朱 英 国 , 利 用 致谢 在此作者非常感谢海南省热带农业资源研究 所所长方宣钧博士对本研究工作的具体指导和论 文手稿的认真审阅 ; 感谢海南省农作物分子育种 重点实验室提供科研条件和经费支持 。本研究由 国家 863 计划 ( 批准号 : 2001AA211091 、海南 省自然科学基金项目 ( 批准号 : 3003 及 2001 年 海南省科学事业费项目资助 。 李进波 , 牟同敏 , 方宣钧 , 12 个水稻光温敏核不育系的 李进波 , 牟同