心肌α肌球蛋白重链启动子驱动的绿色荧光蛋白表达载体的构建及鉴 医学论文

1、    心肌肌球蛋白重链启动子驱动的绿色荧光蛋白表达载体的构建及鉴 医学论文                                         关键词】   心作者：

2、潘国栋 黄永章， 郭凌郧， 唐俊明， 孔 霞， YANG Qinglin， 王家宁 本文由中国论文范文收集整理。肌特异性；肌球蛋白重链；启动子；增强型绿色荧光蛋白；干细胞          目的： 构建并鉴定心肌肌球蛋白重链启动子驱动的绿色荧光蛋白表达载体（MHC-EGFP），该基因只在心肌中特异性表达。 方法 ： 设计5和3分别具有SalI/Hind酶切位点的EGFP引物，聚合酶链反应法（PCR）从pLEGFP质粒中扩增增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的cDNA，插入pGEM-T Easy载体表达盒，构建pGEM-EGFP，

3、SalI/Hind双酶切后回收729 kb片断，插入经相同酶切的含5.5 kb心肌特异性肌球蛋白重链启动子的pNC26质粒，构建pMHC-EGFP。连接产物转化感受态DH5，挑选克隆，PCR扩增鉴定，重组质粒经NotI酶切，回收7.2 kb MHC-EGFP表达盒。分离培养小鼠心肌细胞与骨骼肌成肌细胞。MHC-EGFP表达盒通过脂质体法分别转染心肌与骨骼肌成肌细胞。荧光显微镜观察转染细胞是否出现绿色荧光，以鉴定MHC-EGFP表达盒是否具有表达特异性。结果： EGFP cDNA正确插入pNC26质粒中MHC启动子3端。成功转染MHC-EGFP表达盒的心肌细胞出现绿色荧光，而转染的骨骼肌成肌细胞

4、无荧光出现。结论： MHC-EGFP表达盒具有心肌特异性表达特性，为进一步监测干细胞向心肌分化 研究 奠定基础。      心肌特异性；肌球蛋白重链；启动子；增强型绿色荧光蛋白；干细胞    Abstract: Objective To construct and identify the cardiac  -myosin heavy chain promoter (MHC) -driven enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression vector (p

5、MHC-EGFP), which solely expresses EGFP in cardiomyocytes. Methods EGFP cDNA primers were synthesized with forward primer and reverse primer containing SalI and Hind, respectively. EGFP cDNA was amplified by polymerase chain reaction (PCR), added single deoxyadenosine at 3 ends, and subcloned into pG

6、EM-T easy vector to construct pGEM-EGFP. The fragment of 729 bp from SalI/Hind-digested pGEM-EGFP was subcloned into pNC26, a plasmid carried 5.5 kb MHC promoter, to construct pMHC-EGFP. The expression cassette of 7.2 kb MHC-EGFP was recovered with low melting point agarose electrophoresis. Mouse ca

7、rdiomyocytes and skeletal muscle myoblasts were isolated and cultured in vitro. MHC-EGFP expression cassette  was transfected into cardiomyocytes and myoblasts, respectively. EGFP expression was observed under fluorescent microscope. Results EGFP cDNA was successfully inserted into the 3 ends o

8、f MHC promoter. The green fluorescence could be observed in transfected cardiomyocytes, but not in transfected myoblasts. Conclusion  MHC-EGFP expression cassette can be specifically expressed within cardiomyocytes, which provides a basis to monitor the differentiation of stem cells into cardio

9、myocytes.    Key words:Cardiac-specific; Myosin heavy chain; Promoter; Enhanced green fluorescent protein; Stem cells   近年来日益兴起的大量干细胞研究证实，胚胎或成体间充质干细胞在一定条件下可以分化为心肌样细胞，为心脏疾病的 治疗 带来了希望。然而这些心肌样分化的干细胞是否具有成年心肌的收缩和传导功能， 目前 研究还相当缺乏。这是因为通过免疫组织化学或细胞化学染色判断干细胞分化，需要先对细胞进行固定处理，不能在活细胞

10、状态下观察干细胞的心肌分化。本研究将心肌特异性肌球蛋白重链（alpha-myosin heavy chain, MHC）启动子与增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）连接，构建在心肌中特异表达的报告基因系统，使之用于在活细胞状态下观测判断干细胞的心肌分化，为深入进行干细胞的心肌分化研究奠定基础。     1  材料与方法     1.1  材料限制性内切酶SalI、Hind、NotI以及200 bp DNA ladder和Lambda DNA/Hind

11、 markers购自华美生物工程公司；Taq聚合酶、T4 DNA连接酶、dNTP和dATP购自Promega公司；pfu DNA聚合酶购自New England Biolabs公司；Lipofectamine 2000阳离子脂质体购自Invitrogen公司，DMEM培养基购自Gibco公司；新生牛血清购自四季青生物材料有限公司；包含5.5 kb MHC启动子的pNC26质粒由Morehouse School of Medicine提供；包含EGFP cDNA的pLEGFP-C1质粒购自Clontech公司；pGEM-T Easy Vector系统购自Promega公司；5端加有SalI和Hind酶切位点的EGFP cDNA PCR上下游引物（上游：5-GTC GAC ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG CTG TTC -3，下游：5-AAG CTT TTA CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG -3）由北京赛百盛基因技术有限公司合成。 关键词:蛋白,表达,载体,构建,绿色,启动,医学论文,心肌肌球蛋白重