真题答题大题须稍加整理

1、DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在 聚合酶链式反应实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤变性、复性和延伸。(!)变性（模板DN

2、A解旋）模板DNA经加热至90以上。一定时间后，使模板DNA双链解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。(2)复性（退火）模板DNA经加热变性成单链后，温度降到50左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。(3)延伸DNA模板引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链。循环数变性复性延伸第一次（预变性）94°C，30s30次94，20s52，20s72，20s最后一次（保温）72，30s(2)琼脂糖凝胶电泳DNA在电厂作用下，可以由电源的负极向正极泳动，泳动的速度与DNA片段

3、的长度成负相关，与电压强度成正比，因此可以分离不同长度的DNA。在有DNA marker（不同已知碱基对大小的DNA片段的混合物）的条件下，由于不同碱基大小的DNA片段在琼脂糖凝胶上涌动的速度不同，因此电泳完毕后会出现在胶块的不同位置。通过将扩增出的DNA片段与已知的条带做比较，可以大概推测出该片段的碱基对的大小。如果要进一步检测其大小，可以换另外规格的DNA marker 继续电泳。核酸荧光染料可以与DNA嵌合，一起电泳，DNA图谱观察仪可以激发特定的蓝色光源，荧光染料在该光照射下可见到荧光，荧光的亮度与DNA大小成正比。三、实验仪器及试剂7种PCR组分 微量可调移液器 离心管 PCR仪 水

4、平电泳槽 电泳仪电源 紫外分光光度计 250ml锥形瓶(封口膜) 记号笔 卫生纸四、实验步骤1、DNA体外扩增(1) 将所有试剂管瞬时离心一次（4000r/min,1min），使管壁没有残留药品，在引物I 和引物II的离心管内用移液器各加入40ul双蒸水（ddH2O），混匀后瞬时离心一次。所有的离心管都摆到双面板上。(2)向装有Taq DNA 聚合酶的离心管按下表加入以下成分：10x Buffer50 LMgCl250 LdNTP mixture20L上游引物(引物I)25L下游引物(引物II)25 L模板DNA25 LddH2O290L原有的Taq DNA 聚合酶有15ul，此时混合液体系共

5、计500ul,此步骤由第一、二组同学合作完成。（在实验老师的监督指导下操作，确保此后其他同学的实验顺利进行）(3)共分25组，第一、二组的同学并入其他小组进行实验。每组取20ul的上述混合液于0.5ml的离心管中，加入15ul的液体石蜡封闭体系，以防止在加热过程中蒸发。(4) 对自己组的离心管上进行标记之后，放到PCR仪上进行DNA扩增。2、琼脂糖凝胶电泳检测DNA（1）用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子。（2）配制浓度为1%（1 g/100 mL）的琼脂糖凝胶2块。在锥形瓶中，称取1g的琼脂糖粉，加入100ml 1x电泳缓冲液，用封口膜封住瓶口后在微波炉内加热，使琼脂

6、糖粉熔化，然后冷却至60 ，倒入电泳槽中（每块胶50ml），插好梳子，待其凝固。（电泳槽首先用透明胶带将两端封住再进行倒胶）（3）待胶凝固后，去掉胶带纸，小心移去梳子，注意不要破坏加样孔。将倒胶槽至于水平电泳槽内，梳井（点样孔）一端朝负极方向。向电泳槽中缓缓倒入1x电泳缓冲液，以没过胶面2 mm为宜。（5）将80ul的6xLoading Buffer 加入到80ul的核酸荧光染料中，按1:1比例混合。（6）移液器枪头插入到扩增出的样品离心管的底部，吸取20ul样品于另一0.5ml的离心管中，注意不要吸到液体石蜡，再加1ul的染料混合液，充分振荡混匀。用移液器吸取10ul缓慢加入梳井内，枪头抵到

7、梳井口，以防止样液被缓冲液冲散，此外，为防止手抖将凝胶破坏，可以用左手扶住右手的手腕。（6）盖上电泳槽盖，接通电源，电压为80 V，电流最大。（7）当指示剂移动到凝胶中间时，断开电源，终止电泳。（8）取出凝胶块，在DNA图谱观察仪中观察电泳带及其位置，判断扩增产物的情况。3、紫外分光光度计检测DNA含量（1）最后1组取2ulPCR反应液，加入98ul蒸馏水，将样品稀释50倍。（2）以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。（3）加入DNA稀释液100ul至比色杯中，测定260nm处的光吸收值。（4）根据下面的公式计算DNA含量：DNA含量（ul/ml）=50*（

8、260nm的读数）x稀释倍数 五、注意事项 1 离心机上盖没有锁，在离心机运转时，转速最高可达16000r/min，如果这时打开离心机上盖，里面的离心管就会甩出，对人身造成危险，切忌等全部停下来之后再打开上盖取出离心管。另外，离心管一定要对称放置。 2 水平电泳槽在电泳时一定要盖上上盖，此时的缓冲液电压可以达到80V，大大超过了人体的安全电压，切忌不能用手触碰缓冲液或者是电源两端接头。 简答题 1. 氨基酸脱氨后产生的氨和-酮酸有哪些主要的去路？ 答：氨基酸经脱氨基后所生成的氨进入血液，由丙氨酸及谷氨酰胺两种形式运输，大部分在肝中合成尿素，只有少部分在肾以铵盐形式由尿排出。氨基酸经脱氨基后所生

9、成的-酮酸可以进一步代谢，主要有三条代谢途径。 （1）经氨基化生成非必需氨基酸：哺乳类动物体内的一些非必需氨基酸一般通过-酮酸氨基化而生成。 （2）转变成糖及脂类：-酮酸可以转变为糖和脂肪。分别用各种不同的氨基酸喂养人工造成糖尿病的犬时发现，大多数氨基酸可使尿中葡萄糖的排出量增加，少数几种（异亮、苯丙、酪、苏及色氨酸）可使尿中葡萄糖和酮体的量都增加，而亮氨酸和赖氨酸只能使尿中酮体的排出量增加，因此将氨基酸分为三大类：生糖氨基酸、生酮氨基酸和生糖兼生酮氨基酸。 （3）氧化供能：-酮酸在体内可通过三羧酸循环和生物氧化体系，彻底氧化为CO2和H2O，同时释放能量供生理活动的需要。 2氨在血液中是如何

10、转运的？ .答：氨是有毒物质，各组织中产生的氨必须以无毒性的方式经血液运输到肝合成尿素或运到肾以铵盐的形式随尿排出，现已阐明，氨在血液中主要以丙氨酸及谷氨酰胺两种形式运输的。 （1）丙氨酸-葡萄糖循环：肌肉中的氨基酸经转氨基作用将氨基转给丙酮酸生成丙氨酸，丙氨酸经血液运到肝脏。在肝中，丙氨酸通过联合脱氨基作用，释放出氨，用于合成尿素。转氨后生成的丙酮酸经糖异生途径生成葡萄糖。葡萄糖由血液输送到肌组织，在肌组织中葡萄糖分解转变成丙酮酸，丙酮酸再接受氨基生成丙氨酸。丙氨酸和葡萄糖反复地在肌肉和肝脏之间进行氨的转运，所以将这一途径称为丙酮酸-葡萄糖循环。通过这个循环，即使肌肉中的NH3以无毒的丙氨酸

11、形式运输到肝，同时，肝又为肌肉提供了生成丙酮酸的葡萄糖。由此具有重要的生理意义。 （2）谷氨酰胺的运氨作用：谷氨酰胺是另一种转运氨的形式，它主要从脑、肌肉等组织向肝或肾运氨。氨与谷氨酸在谷氨酰胺合成酶的催化下生成谷氨酰胺，并由血液运输到肝或肾，再经谷氨酰胺酶水解成谷氨酸和氨，氨在肝脏中可用于合成尿素，解除氨毒，在肾脏则与H+结合并以NH4+盐形式随尿排出。3. 试述血氨的来源和去路。答：体内氨的来源主要有三方面：氨基酸、胺类物质氧化分解产NH3；肠道吸收的NH3；肾小管上皮细胞产生的NH3。（1）氨基酸脱氨基生成的氨是体内NH3的主要来源。胺类物质氧化分解也可产生NH3。（2）由肠道吸收的NH

12、3包括两部分：氨基酸在肠道细菌作用下产生的氨尿素经肠道细菌尿素酶水解产生的氨，肠道产NH3量较多，每日约4克。（3）肾小管上皮细胞产生的NH3主要来自谷氨酰胺，谷氨酰胺在谷氨酰胺酶的催化下水解成谷氨酸和NH3。这部分NH3分泌到肾小管管腔中与尿中的H+结合成NH4+,并以铵盐的形式随尿排出，对调节机体的酸碱平衡起重要作用。氨的主要去路：（1）氨主要在肝脏经尿素循环合成尿素。（2）合成谷氨酰胺（3）合成非必需氨基酸4试述尿素合成的过程和特点。.答：尿素合成的过程：（1）氨基甲酰磷酸的合成：反应在线粒体中进行。氨可与CO2可在氨基甲酰磷酸合成酶（CPS-）的催化下，合成氨基甲酰磷酸。（2）瓜氨酸的

13、合成：反应在线粒体中进行。在氨基甲酰转移酶的催化下，氨基甲酰磷酸与鸟氨酸缩合生成瓜氨酸。（3）精氨酸的合成：反应在胞液中分两步进行。首先，瓜氨酸在线粒体合成后，被转运到线粒体外。在胞液中，在精氨酸代琥珀酸合成酶催化下，瓜氨酸与天冬氨酸反应生成精氨酸代琥珀酸，由ATP供能。其后，精氨酸代琥珀酸再经精氨酸代琥珀酸裂解酶催化，裂解成精氨酸及延胡索酸。（4）精氨酸水解生成尿素：反应在胞液中进行。在胞液中，精氨酸受精氨酸酶的作用，水解生成尿素和鸟氨酸。鸟氨酸通过线粒体内膜载体转运再进入线粒体，并参与瓜氨酸合成。如此反复，完成尿素循环。尿素合成的特点：鸟氨酸循环先在线粒体中进行，再在胞液中进行。每进行一次

14、循环，就能合成一分子尿素，需要两分子的NH3和一分子CO2, 2分子NH3。一分子来自体内氨基酸脱氨基生成，另一个由天冬氨酸提供，而天冬氨酸又可由其它氨基酸通过转氨基生成。因此，尿素分子中的两分子NH3都是直接或间接来自于各种氨基酸。另外，每合成一分子尿素消耗3分子ATP，4 个高能磷酸键。 5. （1）何为一碳单位？写出四种体内重要的一碳单位基因。 （1）某些氨基酸在代谢过程中可以产生含有一个碳原子的基团，称为一碳单位。体内的一碳单位有：甲基（-CH3）, 亚甲基（-CH2-），次甲基（-CHO=），甲酰基（-CHO），亚氨甲基（-CH=NH）。 （2）一碳单位的辅酶是什么？又如何与之结合？

15、 （2）四氢叶酸是一碳单位的载体，即四氢叶酸是一碳单位代谢的辅酶。一碳单位通常结合在FH4分子的N5、N10位。 （3）一碳单位还要来源于哪几种氨基酸代谢？ （3）一碳单位主要来源于丝，甘，组和色氨酸的代谢。 （4）简述一碳单位的生理功能 （4）一碳单位的生理功用：作为合成嘌呤和嘧啶的原料：如：N10-CHO-FH4、N5N10-CH-FH4提供嘌呤环C2、C8的来源。N5N10-CH2-FH4提供胸苷酸的甲基来源。把氨基酸代谢和核酸代谢联系起来。药理作用：磺胺药通过干扰细菌、恶性肿瘤细胞的叶酸、四氢叶酸的合成，进一步影响一碳单位代谢与核酸合成。 6. 甲基化作用是体内重要的代谢反应，具有广泛

16、的生理意义。哪种氨基酸可以提供甲基？其活性形式如何？又如何代谢转换，重新生成循环利用？ .答：（1）甲硫氨酸可以提高甲基分子中含有S-甲基，通过各种转甲基作用可以生成多种含甲基的重要生理活性物质。 （2）活性形式是S-腺苷甲硫氨酸，甲硫氨酸在转甲基之前，必须首先与ATP作用，生成S-腺苷甲硫氨酸（SAM）。SAM中的甲基称为活性甲基，SAM称为活性甲硫氨酸。 （3）甲硫氨酸以SAM的形式供甲基后，S-腺苷同型半胱氨酸进一步转变成同型半胱氨酸，同型半胱氨酸可接受N5-CH3-FH4提供的甲基再重新形成甲硫氨酸，形成一个循环过程。 什么是核酸的核酸的变性、复性和杂交：（一） 变性在一定理化因素作用

17、下，核酸双螺旋等空间结构中碱基之间的氢键断裂，变成单链的现象称为变性（denaturation）。引起核酸变性的常见理化因素有 加热、酸、碱、尿素和甲酰胺等。在变性过程中，核酸的空间构象被破坏，理化性质发生改变。由于双螺旋分子内部的碱基暴露，其A260值会大大增加。 A260值的增加与解链程度有一定比例关系，这种关系称为增色效应（hyperchromic effect）。如果缓慢加热DNA溶液，并在不同温度测定其A260值，可得到 “S”形DNA熔化曲线（melting curve）。从DNA熔化曲线可见DNA变性作用是在一个相当窄的温度内完成的。当A260值开始上升前DNA是双螺旋结构，在上

18、升区域分子中的部分碱基对开始断裂，其数值随温度的升高而增加，在上部平坦的初始部分尚有少量碱基对使两 条链还结合在一起，这种状态一直维持到临界温度，此时DNA分子最后一个碱基对断开，两条互补链彻底分离。通常把加热变性时DNA溶液A260升高达到最 大值一半时的温度称为该DNA的熔解温度（melting temperature Tm），Tm是研究核酸变性很有用的参数。Tm一般在8595之间，Tm值与DNA分子中G C含量成正比。（二） 复性变性DNA在适当条件下，可使两条分开的单链重新形成双螺旋DNA的过程称为复性（renaturation）。当热变性的DNA经缓慢冷却后复性称为退 火（annea

19、ling）。DNA复性是非常复杂的过程，影响DNA复性速度的因素很多：DNA浓度高，复性快；DNA分子大复性慢；高温会使DNA变 性，而温度过低可使误配对不能分离等等。最佳的复性温度为Tm减去25，一般在60左右。离子强度一般在0.4mol/L以上。（三） 杂交具有互补序列的不同来源的单链核酸分子，按碱基配对原则结合在一起称为杂交（hybridization）。杂交可发生在DNA-DNA、RNA-RNA 和DNA-RNA之间。杂交是分子生物学研究中常用的技术之一，利用它可以分析基因组织的结构，定位和基因表达等，常用的杂交方法有Southern印迹 法，Northern印迹法和原位杂交（insi

20、tu hybridization）等。核酸的变性和复性变性(denaturation)和复性(renaturation) 是双链核酸分子的二个重要物理特性。也是核酸研究中经常引用的术语。双链DNA,RNA双链区,DNA: RNA杂种双链(hybrid duplex)以及其它异源双链核酸分子(heteroduplex) 都具有此性质。蛋白质糖基化修饰主要有N-连接的糖基化和O-连接的糖基化两种类型。前者寡糖基直接连接的氨基酸残基是天冬酰胺（Asn），后者主要是丝氨酸（Ser）和苏氨酸（Thr），此外也可能是羟脯氨酸和羟赖氨酸（如胶原蛋白）。 苏氨酸，丝氨酸、酪氨酸。因为他们有羟基基团，可以和磷酸

21、基团脱水生成磷酸酯lys，arg能被甲基化，就是将氨基和乙酸酐进行反应，得到酰胺类物质，只要N上有H，基本上都可以进行乙酰化氨基的烃基化：氨基酸与RX作用则烃基化而成N-烃基衍氨基酸蛋白质检测方法汇总(2010-11-17 19:06:09)转载标签：杂谈蛋白质检测方法汇总化学测量 2008-11-10 17:42:19 阅读1281 评论1 字号：大中小订阅蛋白质检测方法汇总本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。了解各种测定方法的基本原理和优缺点。 蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Fo

22、lin酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏1020倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：实验对测定所要求的灵敏度和精确度；蛋白质的性质；溶液中存在的干扰物质；测定所要花费的时间

23、。考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： CH2COOH | + 3H2SO4- 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1) NH2 2NH3 + H2SO4 - -(NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4 + 2NaOH - 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完

24、成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以625即得。 五种蛋白质测定方法比较如下：方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明凯氏定氮法（Kjedahl法） 灵敏度低，适用于0.2 1.0mg氮，误差为 ±2 费时 810小时 将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离） 用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰

25、少；费时太长双缩脲法（Biuret法） 灵敏度低120mg 中速 2030分钟 多肽键碱性Cu2?紫色络合物 硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸 用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似紫外吸收法 较为灵敏50100mg 快速 510分钟 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收 各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸 用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正Folin酚试剂法（Lowry法） 灵敏度高5mg 慢速 4060分钟 双缩脲反应；磷钼酸磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原 硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇 耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化考马斯亮蓝法(Br

26、adford法) 灵敏度最高15mg 快速515分钟 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其lmax由465nm变为595nm 强碱性缓冲液；TritonX-100;SDS 最好的方法；干扰物质少；颜色稳定；颜色深浅随不同蛋白质变化二、双缩脲法（Biuret法）（一）实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 H2O O=C C=O HN NH R-CH CH-R O=C Cu C=

27、O HN NH R-CH CH-R H2O 紫色络合物 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为110mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。（二）试剂与器材 1. 试剂： （1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有

28、需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用005N NaOH配制。 （2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4·5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。 2. 器材： 可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。（三）操作方法 1. 标准曲线的

29、测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（2025）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。 2、样品的测定：取23个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。三、Folin酚试剂法（Lowry法）（一）实验原理 这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在

30、已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：?在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。 Folin酚试剂中的磷钼酸盐磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。 Folin酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线

31、也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠氢氧化钠溶液的浓度12倍。 进行测定时，加F olin酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，

32、但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。 此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。 此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20250mg。（二）试剂与器材 1.试剂 （1）试剂甲：（A） （A） 10克 Na2CO3，2克 NaOH和0.25克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O）。溶解于500毫升蒸馏水中。（B） （B） 0.5克硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（A）与1份（B）混合，即为试剂甲。 （

33、2）试剂乙： 在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO4·2H2O）,25克钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫 酸锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。（3）标准蛋白质溶液: 精确称取结晶牛血清清

34、蛋白或 g球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250 mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9 % NaCl溶液。 2. 器材（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）秒表（4）试管16支（三）操作方法 1. 标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（2025）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin酚试剂），同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显

35、色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。 注意：因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。 进行

36、多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。Folin酚试剂法实验表格：管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10标准蛋白质 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 （250mg/ml） 未知蛋白质 0.2 0.4 0.6（约250mg/ml）蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4试剂甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0试剂

37、乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5每管中蛋白质的量（mg）吸光度值（A700） 2. 样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。如上表中的8、9、10试管。 根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。 注意，由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓

38、度（相对于标准蛋白质）。四、改良的简易Folin酚试剂法（一）试剂 1. 试剂甲：碱性铜试剂溶液中，含0.5N NaOH、10%Na2CO3、0.1%酒石酸钾和0.05%硫酸铜，配制时注意硫酸铜用少量蒸馏水溶解后，最后加入。 2. 试剂乙：与前面的基本法相同。临用时加蒸馏水稀释8倍。 3. 标准蛋白质溶液：同基本法。（二）操作步骤 测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同。只是试剂甲改为1毫升，室温放置10分钟后，试剂乙改为4毫升。在55恒温水浴中保温5分钟。用流动水冷却后，在660nm下测定其吸光度值。 改良的快速简易法，可获得与 Folin酚试剂法（即Lowry基本法）相接近的结果。五

39、、考马斯亮兰法（Bradford法）（一）实验原理 双缩脲法（Biuret法）和Folin酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。 1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（

40、特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。 在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。 Bradford法的突出优点是： （1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。 （2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间

41、。 （3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。 此法的缺点是： （1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 g球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。 （2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。 （3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线

42、来测定未知蛋白质的浓度。（二）试剂与器材 1. 试剂： （1）标准蛋白质溶液，用 g球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。 （2）考马斯亮兰G250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。 2. 器材： （1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器 （3）试管16支（三）操作方法 1. 标准方法 （1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.

43、02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。 （2）加完试剂25分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG250试剂。注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。考马斯亮兰法实验表

44、格： 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10标准蛋白质 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10   (1.0mg/ml) 未知蛋白质 0.02 0.04 0.06 (约1.0mg/ml) 蒸馏水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04 考马斯亮蓝 G250试剂 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 每管中的蛋白质量（mg） 光吸收值 （A595） （3）用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，

45、根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。 0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。 2. 微量法当样品中蛋白质浓度较稀时（10100mg/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O, 考马斯亮蓝G250试剂仍加5.0ml, 同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。 0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。六、紫外吸收法 蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含

46、量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。 紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。 此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含

47、有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。 此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。 下面介绍四种紫外吸收法： 1. 280nm的光吸收法 因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。 测定时，将待测蛋

48、白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值A280。蛋白质浓度可控制在0.11.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，A280约为1.0左右。由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。 许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值（A11cm）有文献数据可查，根据此光吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度。下式列出了蛋白质浓度与（A11cm）值（即蛋白质溶液浓度为1%，光径为1cm时的光吸收值）的关系。文献值A11cm,称为百分吸收系数或比吸收系数。 蛋白质浓度 = (A28010

49、)/ A11cm,280nm (mg/ml) (Q 1%浓度?10mg/ml)例：牛血清清蛋白 ： A11cm=6.3 (280nm) 溶菌酶 ： A11cm=22.8 (280nm) 若查不到待测蛋白质的A11cm值，则可选用一种与待测蛋白质的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白质作为标准蛋白质，用标准曲线法进行测定。标准蛋白质溶液配制的浓度为1.0mg/ml。常用的标准蛋白质为牛血清清蛋白（BSA）。 标准曲线的测定：取6支试管，按下表编号并加入试剂：管号 1 2 3 4 5 6BSA（1.0mg/ml） 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0H2O 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0

50、A280 用第1管为空白对照，各管溶液混匀后在紫外分光光度计上测定吸光度A280，以A280为纵座标，各管的蛋白质浓度或蛋白质量（mg）为横座标作图，标准曲线应为直线，利用此标准曲线，根据测出的未知样品的A280值，即可查出未知样品的蛋白质含量，也可以用2至6管A280值与相应的试管中的蛋白质浓度计算出该蛋白质的A11cm,280nm 2. 280nm和260nm的吸收差法 核酸对紫外光有很强的吸收，在280nm处的吸收比蛋白质强10倍（每克），但核酸在260nm处的吸收更强，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm处的消光系数是280nm处的2倍，而蛋白质则相反，280nm紫外吸收值大于2

51、60nm的吸收值。通常： 纯蛋白质的光吸收比值：A280/A260 ? 1.8 纯核酸的光吸收比值： A280/A260 ? 0.5 含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的经验公式，即可算出蛋白质的浓度。 蛋白质浓度=1.45×A2800.74×A260 (mg/ml) 此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所测定的数据来建立的。 3. 215nm与225nm的吸收差法 蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时，可用215nm与225nm吸收值之差，通过标准曲线法来测定

52、蛋白质稀溶液的浓度。 用已知浓度的标准蛋白质，配制成20100 mg/ml的一系列5.0ml的蛋白质溶液，分别测定215nm和225nm的吸光度值，并计算出吸收差： 吸收差D= A215 A225 以吸收差D为纵座标，蛋白质浓度为横座标，绘出标准曲线。再测出未知样品的吸收差，即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。 本方法在蛋白质浓度20100mg/ml范围内，蛋白质浓度与吸光度成正比，NaCl、（NH4）2SO4以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等缓冲液，都无显著干扰作用，但是0.1N NaOH, 0.1M乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的215nm光吸收值较大，必须将其浓度降到0.

53、005M以下才无显著影响。 4. 肽键测定法 蛋白质溶液在238nm处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比。因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列50500mg/ml已知浓度的5.0ml蛋白质溶液，测定238nm的光吸收值A238，以A238为纵座标, 蛋白质含量为横座标，绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由标准曲线求得。 进行蛋白质溶液的柱层析分离时，洗脱液也可以用238nm检测蛋白质的峰位。 本方法比280nm吸收法灵敏。但多种有机物，如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用。所以最好用无机盐，无机碱和水溶液进行测定。若含有有机溶剂，可先将样品蒸干，或用其他方法除去干扰物质，然后

54、用水、稀酸和稀碱溶解后再作测定。考马斯亮兰法（Bradford法）（一）实验原理双缩脲法（Biuret法）和Folin酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是

55、与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠