发酵生产林可霉素项目可行性实施报告

1、发酵生产林可霉素项目可行性研究报告一、项目概述1.1 项目提出背景、意义及必要性林可霉素，国外称林肯霉素(Lincomycin ,LCM,是由美国人Mason 等人于1962年从尼布拉斯加(Nebraska)林肯市(Lin coin )附近土 壤中分离到的一种由林可链霉菌变种所产生的抗生素。林可(肯)链 霉菌属于放线菌的一类，它也是一种新的链霉菌菌种。利用该放线菌 合成林可霉素的过程中除产生抗菌活性最强的林可霉素A (简称LCM外，在一定条件下还产生其 B C、D K、S等类似物。林可霉素 (1incomycin) 是一种高效广谱抗生素。早期报道林可霉 素具有的抗生素间不存在交互抗性，并且毒性

2、很低(Mason and Lewis ,1964) 。林可较好的抗革兰氏阳性菌的能力 (Lewis et ai. 1963)，它与已知霉素被广泛用于由抗革兰氏阳性菌引起的疾病的临床 治疗。目前 , 林可霉素下游产品(如酸克林霉素、克林霉素磷酸脂、克 林霉素棕榈酸脂等)的开发和应用相当活跃，林可霉素在国外的销量 大，近年来我公司生产的该产品供不应求。我公司从 80 年代就开始生产林可霉素， 也是国该产品第一个通过 美国FDA认证的厂家，但由于各方面的原因，发酵生产林可霉素的水 平一直不高。目前，我公司生产的林可霉素产品在国外市场上供不应 求。为了提高林可霉素发酵生产水平，为了抓住当前的市场商机，

3、为 了全面提升我公司的竞争力，特申报该项目，如能得到重点扶持，项 目完成后必将产生重大的经济效益和社会效益。1.2 国外技术现状、专利等知识产权情况分析和我省现有的工作基础1.2.1 国外技术现状、专利等知识产权情况分析(1) 曾经生物反应器技术几乎被国外几家公司垄断，现在国有关生物 反应器产业发展较快，给国发酵过程的优化创造了有利条件。我国生物反应器的研究一直受到国家有关部门的重视，在国家攻 关计划“七五”、“八五期间先后立项，并集中国有关单位攻关，解 决了在生物反应器研制中的几个关键技术问题，并形成了早期产品。 但由于国家攻关计划与产品开发脱节，再由于当时国配套基础差，以 及各种体制和观念

4、上的问题，严重影响产品质量，故长期以来未能在 我国形成规模化的产业。我国商品化生物反应器的市场相当大的一部 分被几家国外公司占领了，主要有德国B.Braun、美国NBS瑞士 BioEngineering 、荷兰 Applikon 、日本丸菱以及韩国高百特等， 占据了我 国市场的 70%左右。近年来，国有关生物反应器产业发展较快，有关产品生产的公司 企业巳达十多家，主要从事一般化的低档产品生产。由于以仿制为主， 研制成本和劳动力成本低，虽然产品的标准下降，但能满足一般用户 的需要，特别对生物技术产业刚起步的、优化放大要求不高的和资金 不足的企业，低价的产品能满足他们的要求，因此已经基本上占领了

5、低价位生物反应器的国市场。但由于这些企业技术力量以模仿为主， 着重于零部件的替换研究以降低生产成本为目标，缺乏生物过程技术 的研究力量，缺乏工艺、工程、装备一体化的研究体制，因而不可能 与生物技术发展有同步生物反应器的开发能力。此外，也缺乏多学科 技术交叉的研究能力，因而只能是简单的外型仿制和跟踪，缺乏创新 的自主知识产权产品。为了适应各种生物技术的实验室成果向产业化 转化的需要，对生物反应器的性能要求愈来愈高。（2）基于多尺度的发酵过程与优化理论给林可霉素发酵过程的优 化提供了新思路基于多尺度理论下的以代谢流分析与控制为核心的发酵过程多参 数相关分析方法。这一方法不仅考虑了基因水平、细胞水平

6、微观状态 下的生物反应及代谢阻遇机理，而且还考虑到宏观生物反应器尺度对 生物发酵过程的影响，把基因水平，细胞水平和生物反应器尺度纳入 统一的系统，进行分析和控制。显然这一方法与单一尺度的静态的分 析方法相比，更符合实际，能更好地解决工业化生产中的放大和优化 问题。中国科学院院士郭慕教授在为本项目参与人嗣良先生的专著 多 尺度微生物过程优化作的序中明确指出“生物系统本身属于高度复 杂的自组织系统，其特征之一是多尺度结构及其部的非线性和非平衡 作用。”“目前使用的基于单一尺度的平均方法，难于反映过程的在机 理，因此预测性差，不易解决定量放大与调控问题。 ”并且认为嗣良教 授的多尺度微生物过程优化理

7、论与技术在分析和有效控制复杂的生物 系统方面是一项创举。1.2.2 现有工作基础我公司有 40 多年的盐酸林可霉素发酵的生产历史 , 有先进的厂房 设备, 有完善的水、电、气等公用系统，有一支多年从事发酵生产研究 的技术队伍，有一整套用于生化工程研究的仪器设备，除了常规的实 验仪器设备如HPLC摇床、离心机等外，还具有完成本项目研究所需 要的设备与配套仪器，其中主要有 FUS-50L 新概念发酵罐，该设备用 于发酵过程分析与控制，该反应器实现了在线的多参数采集与分析， 如温度、搅拌转速、pH溶解氧浓度（DO等的测量与分析，同时还 配置了称重系统和全自动补料系统，如高如基质、前体、油、酸碱物 的

8、自动流加与控制。除上述优点外，该反应器配套的软件包 Bioradar 及 Biostar 1.5 在国外相同发酵控制中处于领先水平，同时为远程通 讯在异地进行数据传送和分析提供了极大方便。我公司十分重视人才培养和产、学、研结合，去年分别与华东理 工大学和师大学签立了关于林可霉素发酵过程的优化、林可霉素高产 菌株的筛选项目，经过合作研究，有些方面取得了突破性进展，为我 公司后续项目的研究打下了深厚的基础。1.3 国外技术发展趋势林可霉素是于 1962年从链丝菌 ( Streptomyces Lineolnensis )变异 株的好氧发酵液中获得的抗生素，抗革兰阳性菌 . 临床上用于肺炎球 菌、溶

9、血性链球菌、草绿色链球菌及金黄色葡萄球菌的感染。特别用 于严重厌气菌引起的感染及金黄色葡萄球菌骨髓炎，在许多感染症的 治疗中疗效显著。由于其对组织和细胞的穿透力强，应用方便，不需 做皮试。林可霉素用药途径较多，副反应较少，控制感染快，是较有 前途的一种抗生素。二、技术方案论述2.1 项目的技术关键，包括技术难点、创新点2.1.1 项目的创新点(1) 基于多尺度理论下的以代谢流分析与控制为核心的发酵过程多参 数相关分析方法在发酵生产林可霉素过程中的具体应用传统的发酵过程优化是以经典动力学为基础、以最佳工艺控制点 为依据的静态操作方法。而多尺度微生物发酵过程优化是以活细胞为 主体的微生物发酵过程，

10、可分为基因尺度、细胞尺度与生物反应器尺 度，是不同尺度的网络状态的输入输出关系，存在着信息流、物质流 与能量流。其中跨尺度观察、分析与控制是微生物发酵过程优化的关 键。故基于多尺度理论发酵过程优化不仅考虑了基因水平、细胞水平 微观状态下的生物反应及代谢阻遏机理，而且还考虑到宏观生物反应 器尺度对生物发酵过程的影响，把基因水平、细胞水平和生物反应器 尺度纳入统一的系统，进行分析和控制。显然这一方法与单一尺度的 静态的分析方法相比，更符合实际，能更好地解决工业化生产中的放 大和优化问题。（2）应用软件包 Bio-star 1.5 ，通过人机界面对发酵过程的相关参数 进行实时监测和关联分析，再结合离

11、线测定参数进行综合分析，找出 工艺关键调控点，实现发酵过程的全面优化我公司去年与华东理工大学生物工程中心签订了基于多尺度理 论发酵生产林可霉素的工艺优化合同，同时派出一批技术骨干到该 校进行理论和实验培训，同年 6 月购置了 FUS-50L 高级全自动控制发 酵罐，该反应器是由国家生化工程技术研究中心（上海）设计，由上 海国强生化工程装备有限公司组织生产的用于生物过程多尺度研究的 新型发酵装置，具有在线参数检测与控制功能。同时，与该反应器配 套的软件包（Bioradar- H及Biostar 1.5 ）具有适应多种反应器特点， 融合多种过程理论和控制理论，便于发酵过程工艺分析和优化操作强 大功

12、能。该装置已先后运用于青霉素、红霉素、金霉素、链霉素、鸟 苷、肌苷、基因工程白蛋白、基因工程植酸酶、基因工程必特螺旋霉 素等产品的发酵生产中，取得了多项成果。通过产、学、研充分结合，现在我们不但在发酵优化理论方面有 很大提高， 同时在中试研究和 60吨实验罐生产中已将发酵水平提高到 一个新的层面，将研究成果运用于生产，已初步实现了发酵工艺的优 化。（3）发酵液流场的模拟、 60 吨罐搅拌与进气结构的改造和工艺的动态 优化相结合发酵过程放大困难的原因就在于放大时不可能同时做到几何相 似、流体运动学相似和流体动力学相似。在小试研究中，当某一个对 生产产生影响的重要因素没有被观察到，而这个因素恰恰在

13、放大时成 为关键因子时，就会造成整个发酵过程的失败。为此，在发酵过程放 大研究时，要在以代谢流分析与控制为核心的发酵实验装置上进行研 究，由此可在放大的设备上得到完全相同的反映代谢流等生理数据的 变化曲线。以上工作还只是生理代谢参数相似的放大原则，并不足以 确定大型发酵罐的几何结构和动力结构等设计参数。因此，将放大规 模的状态参数转化为操作或设计参数还需要一个研究过程。如何在放大的罐体上实现相同代谢流参数的效果，需要生物学、 化学工程、机械制造、传感技术、计算机控制技术的综合利用。（4）将传统的和现代的菌种选育方法充分结合，进行林可霉素高产菌 株的筛选2005 年 10 月，我公司与师大学签订

14、了 林可霉素高产菌株的筛选 合同，同时派出技术骨干到该单位实验室进行全程跟踪实验，创新点 集中在以下几方面： （1） 三重复合诱变技术，采用三种不同的诱变方 法分步处理林可霉素产生菌，促使林可霉素产生菌的DNA多基因位点发生突变，然后采用耐前体物压力梯度筛选方法把高产林可霉素产生 菌筛选出来；（ 2）把三重复合诱变技术和原生质体融合技术结合筛选 林可霉素高产稳定菌株。现已取得了良好效果，为生产菌种的稳定和 发酵水平的提高提供了保证。2.1.2 项目的技术难点 （1）动力学模型的建立有一定难度，给发酵过程优化和放大及生物仿 真造成了一定的障碍发酵过程是一个多因素、动态、非线性的复杂生化过程，由于

15、发 酵过程中酶动力学实验研究的困难，以及发酵过程控制中某些动态数 （如动力学粘度）据采集和处理的困难，使发酵工业化生产时，基本 上不可能建立（个别特殊情况例外）完全的微生物反应动力学与条件 参数相关联的模型，这给发酵过程的优化和放大带来了一定的困难。 虽然 FUS-50L 高级全自动控制发酵罐采用了先进、可靠的传感器，采 集了十几个参数，同时具有高精度参数测量和精确的补料系统。Bioradar- H及Biostar 1.5软件包开发了自诊断程序、自适应程序等, 保证了系统的稳定、可靠运行，保证了一些数据采集的实时性和关联 性。但是，由于发酵生产过程的复杂性和多样性，本调控系统仍然需 要根据实际

16、情况，特别是结合林可霉素发酵过程的特点进行一定的修 正或改进，同时根据小试、中试和 60 吨罐生产实验积累丰富的数据， 一方面可建立完善的专家系统，另一方面可建立生物仿真系统，从而 实现智能化的发酵过程优化。（2）在生产上实现发酵工艺的实时动态优化也具有一定难度 良性的工业化大生产与小试、中试实验是有较大区别的，它是一个集先进管理、规的工艺操作与相关技术人员对动态发酵过程有较高 的认识水平于一体的群体行为。 由于目前 60 吨罐的多参数采集系统仍 然没有建立，同时还存在着其他方面的原因，这样给发酵工艺的实时 动态优化造成了较大困难。（3）林可链霉菌属放线菌，而放线菌的生产稳定性一般不好，这样给

17、 菌种的选育和保藏提出了很高的要求。菌种筛选的技术关键体现在以 下三方面：三重复合诱变处理技术； 耐前体物压力梯度筛选方法； 双亲本菌株原生质体融合技术。2.2 、项目计划目标及主要研究容2.2.1 主要目标通过林可霉素高产菌株的筛选和基于多尺度发酵工艺的优化与发 达研究，稳步提高林可霉素发酵单位，从全方位提高生产效益和降低 产品成本。主要达到以下目标：在192小时发酵周期，50L发酵罐林 可霉素发酵单位在7500u/ml以上；60T发酵罐发酵水平提高30%以 上，发酵总亿在360十亿以上；申报关于林可霉素高产菌株和过量 生产林可霉素发酵工艺的专利；在中文核心期刊发表论文3篇。 2.2.2 研

18、究与开发容（A）发酵罐放大实验通过摇瓶、FUS-50L罐和60吨大罐的联动实验，对多参数采集系 统采集的数据进行多尺度分析，建立优化的工艺调控平台，逐步实现 大罐生产工艺的全面优化。（a） 大罐的数据采集系统改造 数据采集是进行过程放大与优化的基础，可根据企业的生产实际 情况和资金情况，挑选出一个合适的发酵罐，对其进行必要的检测系统设备改造，逐步实现“全参数”采集，即可以一边增加所需的检测参数，一边就可以采集已有的数据，尽早地进行相关数据分析。rlrli<1pll_£L丄? $11 I?机软件和上位机软件两部分。下位机软件负责在线参数采集、离线参数计算、参数数据记录， 并且同步

19、向上位机传送所有在线参数的数据；上位机软件用于工艺人员的数据分析及工艺优化，选用了 C+语言进行编程设计，采用多线程、COM等编程技术。此外，通过In ternet 网络，可以用e-mail向位于远程（上海）专家的计算机传送数据。远程专家接收到数据以后进 行工艺分析，然后将工艺控制指令下达给车间现场的工艺工程师，再由工艺工程师具体实施 控制指令，达到工艺优化控制的目的。图1计算机检测系统传家计算机下位机图2数据远程传递系统Internet表1在线检测参数一览表在线检测参数输出信号安装位置1温度4-20mA已有2pH4-20mA罐体中部3溶氧4-20mA罐体中部4转速4-20mA5尾气Q4-20

20、mA排气管弯头6尾气CO4-20mA顶部7罐压4-20mA上封头8空气流量0-10mA进气管9发酵液体积4-20mA上封头和桶底其中，温度为车间原有系统中已有的信号，EQ、ECQ、罐压、pH 溶氧、流量、转速、体积为本次改造中增加的测量信号，间接参数为 QUR CER RQ &a以及补料速率。在数据采集系统改造过程中，可按照“边改造，边采集”的原则， 尽早地将已有数据采集起来，以进行必要的分析。(b)搅拌桨叶的组合实验首先要检测大罐溶氧水平，对大罐的溶氧变化进行分析。如果发酵 过程中溶氧水平长时间很低，这样会影响产素水平，可以通过更换搅 拌桨、增加通气等方式增加大罐的供氧水平。具体可在

21、小试罐上实验 不同搅拌桨型式的组合(部分实验已进行，并已取得结果)，然后在大 罐上放大：表2不同搅拌桨型式的组合表组合上层中层下层1（工厂原始）箭叶箭叶箭叶2 （小试已试）箭叶箭叶六平叶3四宽折叶四宽折叶半圆管4四宽折叶四宽折叶平叶5弯叶弯叶弯叶6弯叶弯叶平叶7斜叶斜叶斜叶8平叶平叶平叶同时还可以研究不同搅拌桨型下的功耗，寻找出混合好、功耗少的 最佳组合。（B）工艺优化实验（a）工艺优化实验研究对于目前工厂已有的补料形式，可在不改变补料形式的前体下，试验“少量多次”的补料方式，以减少 pH等参数的波动幅度对产素的 影响，减低瞬时底物浓度高对供氧的压力。（b）菌丝形态学研究结合小试结果，控制玉米

22、浆补料方式，不是“每班必补”，而是根 据过程菌形，加以适当控制。（c ）比生长素率控制的研究在小试的结果上，通过控制补糖、玉米浆水、通氨等方式，控制 菌浓，在供氧基本满足的前体下，达到一个合适菌浓水平的控制。（d）碳源、氮源优化实验试验在总碳源浓度一定的情况下，淀粉：葡萄糖不同比率下的生 长和产素情况。(e)细胞膜通透性改变对抗生素生产速率的影响( f )外源影响因子对林可霉素生物合成速率的影响(C) 代谢流分析( a )有机酸的测定 由于发酵过程中，产生的一些有机酸和氨基酸可反映该过程的代 谢状态，并可对代谢途径的通量进行定性分析。现拟用 HPLC法测下列 有机酸：丙酮酸，a -酮戊二酸，乙

23、酸，柠檬酸，丙酸，琥珀酸。( b )酶动力学研究 根据所测定的糖代谢途径关键调控酶活性的大小，可定性分析代谢途径通量的相对大小，对全过程的关键调控酶活性进行合理调控， 使代谢流向预期方向流动， 可实现生产过程的优化。 拟测定的酶活： 1) 磷酸果糖激酶， 2)葡萄糖脱氢酶， 3)柠檬酸合成酶， 4)异柠檬酸脱 氢酶。三、必要的支撑条件、组织措施及实施方案3.1 必要支撑条件( 1 )技术支撑国家生化工程技术研究中心(上海)的嗣良教授为本项目的重要 参与人，他针对单一尺度的过程分析，提出了发酵过程多尺度问题分 析，形成了基于参数相关的发酵过程多水平问题研究的优化技术和发 酵过程多参数调整的放大技

24、术，开发了适应代谢流检测与分析原理的 装置，研制成功了在原理与配置上与现有国外生物反应器有重大差别 的装置。 由此所形成的发酵优化技术与方法成果的推广 , 己为全国多家 企业培养了一批掌握本技术的企业技术骨干 , 增强了企业的市场竞争 能力，推动了我国传统和现代生物技术发酵行业现代化技术改造，缩 短了这一领域的国际差距。完成的“基于参数相关的发酵过程生物反 应器优化与放大技术”获 2002 年国家科技进步二等奖。 （2）经济支撑公司于一九八九年晋升为国家二级企业，一九九二年由国家经贸 委等部门批准取得外贸进出口自主权，一九九四年由国家经贸委确定 为国家大型一档企业，同年被中国质量管理协会授予“

25、全国用户满意 企业”，系国家中药重点五十强企业和医药行业的百强企业之一。公司有近 50 年中药生产和 30 余年西药生产历史。现有资产总额 41228万元，净资产 10378万元。主要生产设备 3300 余台套，生产发 酵容量 2100 立方米，动力系统水、电、汽、空气、冷冻、真空等与生 产相配套，其规模在省医药行业位居前列。公司目前固体制、原料药 已经通过GM检查。公司现有品种 180 余个，主要产品有发酵虫草菌粉（ CS-4 ）、盐酸 林可霉素、盐酸土霉素、十三碳二元酸等原料药及中成药（片剂、胶 囊剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、颗粒剂等）和西药制剂（片剂、胶囊 剂、注射剂）。注册商标为“赣鹰”

26、牌。其中二个产品获国家质量银质 奖，三个产品获部优奖，八个产品获省优奖。发酵虫草菌粉及金水宝 胶囊是国家第一个中药一类新药，盐酸土霉素和盐酸林可霉素两个产 品多次通过美国FDA复检认证，盐酸土霉素、盐酸林可霉素、发酵虫 草菌粉和十三碳二元酸四个产品畅销欧美市场， 为国家创收大量外汇， 而且是公司利润的主要来源。（3） 人才支撑 我公司十分重视人才引进和人才培养，近年来，公司每年录用品学兼优的大学生1020名，创造各种机会对这些大学生进行培养；2005 年3月7月，公司派技术骨干到华东理工大学进行理论和实验培训； 2005年 9 月今，华东理工大学先后派出 8 位专家到现场指导和进行 实验研究；

27、 2006年 1 月今，我公司派技术骨干 4名到师大学参加“林 可霉素高产菌株的选育”课题研究。3.2 组织管理的措施（1）项目实行法人总负责制，由国药有限责任公司药物研究所对项 目实行管理、指导和监督，由葛友群具体组织和管理本项目。（2）本项目实行“课题子课题”两级管理。（ 3）项目实行经济责任制。要将分级子课题进一步细化，要求落实 到部门，甚至落实到人，同时制定详细的实验研究进度。（4）实行重大事项报告制度。课题责任人对课题执行过程中发生的 技术路线或主要研究容调整、课题组主要研究人员变动以及其它可能 影响课题顺利完成的重大事项及时向国药有限责任公司药物研究所报 告，并按我公司科研计划管理

28、办法规定的程序报批。并按我公司科研 计划管理办法规定的程序报批。3.3 组织实施的方案（1 ）项目研究时间2005年1月2007年12月(2)项目研究分为五阶段 第一阶段( 200 年 1 月 2005 年 3 月)主要工作(A) 项目查新已完成。(B) 中英文文献的查阅与整理，撰写关于项目文献综述已完成。(C) 到与本项目研究密切相关的高等院校进行调研，签订技术合作协议2005 年 1 月 2005 年 3 月，我公司派出专家及相关技术骨干先 后到华东理工大学、师大学、农业大学等高等院校进行调研，并同嗣 良等国著名的发酵工程专家进行了本项目的广泛探讨。 2005 年先后同 华东理工大学、师大

29、学签立了技术合作项目。 第二阶段主要工作技术骨干的培训。 2005 年 3 月 2005 年 7 月，我公司先后派出二 十余名林可霉素发酵生产线的技术骨干到华东理工大学生物工程学院 发酵工程实验室进行理论和实验方面的培训；同时，在此期间，完成 了摇瓶和 50L 罐发酵生产林可霉素的初步优化实验。 第三阶段 2005 年 8 月 2006年 9 月主要工作( A) 建立中试实验室2005 年 8 月 10 月，在国药有限公司建立了面积为 200m2 的中试 实验室，并投资120万元购置了 FUS-50L新概念发酵罐等科研设备和 仪器。(B)与高校联合研究项目的全面启动2005 年 9 月华东理工

30、大学生物工程中心派出 1 名博士到我公司 进行发酵生产林可霉素的工艺优化与放大研究，随后又派来 1 名硕士 同样进行该课题研究； 2006 年元月，华东理工大学博士生导师嗣良教 授和储炬教授一行 6 人到我公司进行现场指导， 并进行阶段总结； 2006 年元月，我公司派出 4 名技术骨干到师大学进行林可霉素高产菌株的 选育。 第四阶段(2006年10月2007年10月)主要工作(A) 大罐多参数采集系统的购买与安装正在申报计划。(B) 放大研究正在进行。(C) 中期验收 第五阶段(2007年11月2007年12月)主要工作结题验收。3.4 、计划实施年限、经费预算及来源渠道3.4.1 年度计划2005年3月 2005年9月摇瓶实验(种子培养基优化、发酵培养基优化)、50L罐发酵工艺优化实验、60m3罐发酵工艺优化探索实验 2005年10月2006年9月 50L 罐搅拌桨叶组合优化实验、 60吨罐生产 工艺的稳定和进一步优化实验2006年10月2007年1月外源因子对林可霉素生物合成的影响及原理分析实验2007年2月2007年6月 60吨