实验十七（2）烟草原生质体融合

1、实验十七实验十七 （2）烟草原生质体融合）烟草原生质体融合一、原理一、原理 PEG带微弱极性的负电荷，能与水、蛋白质和碳带微弱极性的负电荷，能与水、蛋白质和碳水化合物等具有正电荷基团的分子形成氢键。在邻近水化合物等具有正电荷基团的分子形成氢键。在邻近原生质体表面之间起着分子桥的作用，加上原生质体表面之间起着分子桥的作用，加上PEG渗透渗透吸水的作用，使原生质体相互接触在一起。吸水的作用，使原生质体相互接触在一起。 在洗涤过程中，直接或间接与质膜结合的在洗涤过程中，直接或间接与质膜结合的PEG分分子从原生质体表面洗脱，并随着子从原生质体表面洗脱，并随着pH的降低，导致膜电的降低，导致膜电荷的不平

2、衡和发生重新分布；在原生质体荷的不平衡和发生重新分布；在原生质体 吸水过程中，吸水过程中，发生原生质体融合。发生原生质体融合。二、实验目的二、实验目的 学习植物原生质体融合的方法，为进行体细学习植物原生质体融合的方法，为进行体细胞杂交，培育体细胞杂种和胞质杂种打下基础。胞杂交，培育体细胞杂种和胞质杂种打下基础。三、实验材料和用具三、实验材料和用具1、材料：烟草、材料：烟草BY2愈伤组织，烟草组培苗愈伤组织，烟草组培苗2、用具、用具：过滤器，注射筒，不锈钢网筛过滤器，注射筒，不锈钢网筛（ =54 m），漏斗，三角瓶，滴管，），漏斗，三角瓶，滴管，10ml刻度离刻度离心管，血球记数板。心管，血球记

3、数板。四、实验步骤四、实验步骤1、配制酶液、配制酶液 各组（各组（2人）配制下列酶液各人）配制下列酶液各10ml， 4000rpm离心离心6min后过滤灭菌于无菌三角瓶中。后过滤灭菌于无菌三角瓶中。 CPW培养基培养基+0.4mol/L甘露醇甘露醇+2%纤维素酶纤维素酶 +0.5%离析酶离析酶23周龄愈周龄愈伤组织和叶伤组织和叶片各约片各约1g和和0.5g，叶片，叶片剪成细条剪成细条 加入到酶加入到酶液中、用液中、用镊子分散镊子分散愈伤组织愈伤组织黑暗、黑暗、 25酶解酶解56小时，小时，间歇轻轻摇间歇轻轻摇动。动。2、BY2愈伤组织和叶肉原生质体分离愈伤组织和叶肉原生质体分离3、过滤和离心洗

4、涤原生质体、过滤和离心洗涤原生质体过过滤滤800rpm离离心心3min弃上弃上清液清液加入加入3ml CPW培养基，用滴培养基，用滴管重新悬浮原管重新悬浮原生质体生质体800rpm离离心心3min弃上清弃上清液液,重新重新悬浮在悬浮在0.5ml CPW溶溶液中液中4、原生质体融合、原生质体融合（1）调整密度：用血球板计数后，将原生质体）调整密度：用血球板计数后，将原生质体的密度调整为的密度调整为106个原生质体个原生质体/ml。（2）配置）配置PEG融合液（无菌下）融合液（无菌下）PEG溶液：甘氨酸缓冲液：溶液：甘氨酸缓冲液：DMSO=8：1：1（3）将愈伤组织原生质体和叶肉原生质体等体）将愈

5、伤组织原生质体和叶肉原生质体等体积混合。积混合。（4）原生质体融合步骤）原生质体融合步骤取取0.2ml混合原混合原生质体生质体悬浮液悬浮液加入加入0.2ml 高钙高高钙高pH PEG融合液融合液静置静置10min5min内缓慢内缓慢加入加入5ml W5稀释液，轻稀释液，轻轻吸打混匀轻吸打混匀静置静置30min800rpm离离心心3min，弃上清夜弃上清夜重新悬浮重新悬浮在在0.5ml W5，静置静置10min（5）融合原生质体的观察）融合原生质体的观察 吸吸1滴融合的原生质体悬浮液于血球计数滴融合的原生质体悬浮液于血球计数板上，在显微镜下融合的原生质体，统计融板上，在显微镜下融合的原生质体，统

6、计融合率。合率。融合原生质体的特征：融合原生质体的特征：A：异源融合；：异源融合；B：同源融合：同源融合融合率融合率=融合的原生质体数融合的原生质体数/观察的原生质体数观察的原生质体数准备下次实验的试剂（各准备下次实验的试剂（各100ml）：）：（1）2CTAB提取缓冲液：提取缓冲液：100mM Tris-HCl（pH8.0），），2（w/v）CTAB，1.4M NaCl，40mM -巯基乙醇，巯基乙醇，20mM EDTA （2）TE缓冲液：缓冲液：10mM Tris-HCl (pH7.4), 1mM EDTA。 （3）50 TAE电极缓冲液：称取电极缓冲液：称取24.2gTris溶解于适量蒸馏溶解于适量蒸馏水中，加入水中，加入5.7ml冰乙酸，冰乙酸，10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)溶溶液，液，定容到定容到100ml。（4）溶液）溶液I：50 mmol/L葡萄糖葡萄糖，25 mmol/L Tris.HCl（pH8.0），），10 mmol/L EDTA（pH8.0） （5）溶液）溶液