花 粉 的 抗 氧 化 性 的 研 究 - 西北大学

1、蜂花粉提取物抗氧化作用的研究厉 阗，曹 炜，宋纪蓉（西北大学 化工学院，陕西 西安，710069）摘要：为进一步开发利用蜂花粉资源，研究5种蜂花粉活性成分的抗氧化性。采用超声法，以甲醇为溶剂提取5种蜂花粉活性成分；测定提取的5种蜂花粉活性成分对超氧阴离子自由基、羟基自由基、DPPH自由基的清除率和脂质过氧化的抑制率。结果表明：5种蜂花粉均具有较强的抗氧化作用，其中荞麦花粉甲醇提取物对超氧阴离子的清除作用和脂质过氧化的抑制能力最强；油菜花粉甲醇提取物对羟基自由基和二苯代苦味酰（DPPH）自由基的清除能力最强。认为蜂花粉是一种有前途的天然抗氧化剂。关键词：蜂花粉；抗氧化作用；甲醇提取物中图分类号：

2、Q5 文献标识码：A 文章编号：1000-274X(2004)0089-06生物体系中存在着大量的脂质氧化和自由基反应。现代医学研究证明，衰老、癌症及炎症等疾病与体内脂质过氧化和自由基有着直接的关系1 。自由基会使体内的脂质和蛋白质发生链式反应，造成相关细胞结构与功能的破坏，其氧化产物和中间产物也会导致生物膜、酶、组织、基因等损伤，使人体发生病变。在抗氧化酶与内源抗氧化剂的合成量降低的情况下，如果不及时从体外补充外源性抗氧化剂以提高机体抗氧化能力，人体就会加速衰老、易患疾病。天然抗氧化剂有抑制体内脂质过氧化和氧自由基的作用，同时可促进体内抗氧化酶与内源性抗氧化剂的合成。因此，对清除自由基和抑制

3、脂质过氧化作用的天然抗氧化剂研究，己得到普遍关注2。花粉是植物的雄性生殖细胞，它存在于雄蕊的花药之中。蜂花粉是蜜蜂采集花粉后用自己的唾液和花蜜粘合形成的颗粒，比单一花粉更有营养价值3。蜂花粉中含有黄酮类、维生素、激素、核酸、酶类和微量元素，具有特有的抗衰老作用，是良好的抗氧化食品。蜂花粉的种类不同，所含成分有很大区别，因此研究不同种类蜂花粉的抗氧化作用具有重要的价值。本文研究蜂花粉甲醇提取物对超氧阴离子、羟基自由基、DPPH自由基的清除与脂质过氧化的抑制作用，通过对比不同蜂花粉对氧自由基的清除率和脂质过氧化的抑制作用，为开发利用蜂花粉资源提供依据。1 材料与方法1.1 材 料1.1.1 样品与

4、试剂 油菜蜂花粉、荞麦蜂花粉、茶叶蜂花粉、芝麻蜂花粉、益母草蜂花粉由陕西老蜂农蜂业有限责任公司提供；二苯代苦味酰自由基( DPPH)为 Sigma公司产品，分析纯；甲醇、硫代巴比妥酸（TBA）等均为国产分析纯试剂。1.1.2 仪 器 UV-751型紫外可见分光光度计，上海分析仪器总厂；KQ-250DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。1.2 方 法1.2.1 蜂花粉活性成分的超声萃取 称取干燥后的5种蜂花粉各2 g，分别用30 mL甲醇在常温下超声提取30 min，过滤后，滤渣再提取一次，合并滤液，弃去滤渣。将所得滤液用旋转蒸发器浓缩，加甲醇定容至10 mL备用。1.2.2 蜂花粉甲

5、醇提取物的抗氧化作用的测定1）蜂花粉对超氧阴离子自由基的清除作用。采用邻苯三酚自氧化速率测定法，25下，在4.5 mL K2HPO4-KH2PO4缓冲液(pH 8.30)中加入7.5 L用10 mmol/L HCl配成的50 mmo1/L邻苯三酚溶液，迅速混匀，倒入光径cm的石英比色杯内，在325 nm波长光线下，每隔30 s测吸光值（A）一次。提取物对碱性邻苯三酚体系产生的超氧阴离子自由基的清除作用按文献4的方法进行。抑制率=(A自氧化A样品)/ A自氧化 ×100%式中：A自氧化 为自氧化对照值，A样品 为 样品值。2）蜂花粉对羟基自由基的清除作用5，6。在10 mL硬质试管中，

6、依次加入KH2PO4-K2HPO4(PH7.4)缓冲液0.4 mL，一定量的样品液（1.04 mmol/L EDTA-1mmol/L FeSO4-1 mmol/L Vc 0.1 mL），12 mmol/L H2O2 0.1 mL，60 mmol/L脱氧核糖(DR)0.05 mL，定容为1.0 mL。然后，将试管置于37的恒温水浴锅中保持1 h，取出，迅速添加1 mL 10% TCA(三氯乙酸)及1% TBA 1 mL,在100沸水中加热15min，取出，冷却，于532 nm处测吸光值。按下式计算清除率抑制率=A模型-(ADR-A样品)/A样品×100%式中： A模型 为 模型管吸光度

7、（不加样品），ADR 为加入清除剂和DR后的吸光度，A样品为样品本身的吸光度（不加DR）。3）蜂花粉对DPPH自由基的清除作用7。蜂花粉提取液2 mL 及2×10-4 mol/L DPPH溶液2 mL加入同一试管中，摇匀。30 min后用溶剂作参比测定其吸光度i ,同时测定2×10-4 mol/L DPPH 溶液与2 mL甲醇溶剂混合后的吸光度AC，以及蜂花粉提取液2 mL与2 mL溶剂混合后的吸光度Aj ，根据公式计算抑制率抑制率=1-(Ai-Aj)/AC×100%4）蜂花粉对脂质过氧化的抑制作用8。取0.2 mL卵磷脂溶液，加入样品，加入50 L FeSO4(

8、347.5 mg FeSO4，35 mg Vc，定容至25 mL)溶液，加PBS缓冲液(p7.4)定容至3 mL，37育温40 min，每5 min摇匀一次。然后，加入TCA和1%硫代巴比妥酸1 mL，摇匀，100水浴15 min，5 000 r/min离心10 min，于532 nm处测定吸光度，用蒸馏水做空白。抑制率=(A模型 A样品)/(A模型A空白)×100%式中：A模型 为模型管的吸光度，A样品 为样品的吸光度，A空白 为 空白管的吸光度。2 结果与分析2.1 对超氧阴离子自由基的清除作用超氧阴离子自由基是第一个生成的氧自由基，又是所有氧自由基的前身，可以转化为其他氧自由基

9、。因此，对超氧阴离子自由基的清除可以有效地减少氧自由基的生成，具有非常重要的意义。图1为5种蜂花粉甲醇提取物对超氧阴离子自由基的清除作用。由图1可知：5种蜂花粉对超氧阴离子自由基均有一定的清除能力，且清除率随提取物加入量的增加而增大，清除能力依次为荞麦蜂花粉芝麻蜂花粉油菜蜂花粉茶叶蜂花粉芦丁对照品益母草蜂花粉；加入量20 L时，荞麦蜂花粉的清除率达27.2%，其他4种蜂花粉的抑制率7.4%16.9%，表明此用量下的5种蜂花粉清除率较低；随着加入量进一步增大，5种蜂花粉和芦丁对照品清除率逐渐增大，当加入120 L时荞麦、芝麻、油菜、茶叶、芦丁、益母草蜂花粉的清除率分别为92.1%、86.5%、8

10、3.2%，、76.3%、70.2%、64.3%，表明此用量下的荞麦、芝麻、油菜蜂花粉、茶叶蜂花粉提取物的清除能力强，而益母草蜂花粉提取物的清除能力相对弱。清除率/%荞麦蜂花粉芝麻蜂花粉油菜蜂花粉茶叶蜂花粉芦丁对照品益母草蜂花粉加入量 /L图1 5种蜂花粉甲醇提取物对超氧阴离子自由基的清除作用Fig.1 Scavenging Effect of Five Kinds of Bee Pollen Extracts on Superoxide Radical2.2 对羟基离子自由基的清除作用羟基自由基是活性氧中最活泼的自由基，也是毒性最大的自由基，几乎能与活细胞中任何分子发生反应，且反应速度极快。图

11、2为5种蜂花粉甲醇提取物对羟基离子自由基的清除作用。110100荞麦蜂花粉芝麻蜂花粉油菜蜂花粉茶叶蜂花粉芦丁对照品益母草蜂花粉清除率/%908070203010060加入量/ L图2 5种蜂花粉甲醇提取物对羟基离子自由基的清除作用Fig .2 Scavenging effect on OH·of Five Kinds of Bee pollen extracts从图2可见：5种蜂花粉甲醇提取物对羟基离子自由基均有较强的清除能力，且清除率随提取物加入量的增加而增大，清除能力依次为茶叶蜂花粉油菜蜂花粉芦丁对照品荞麦蜂花粉芝麻蜂花粉益母草蜂花粉；在反应体系中加入茶叶和油菜花粉提取液5 L的

12、清除率分别为86.9%、83.6%，清除能力较弱的益母草蜂花粉提取物的清除率为65.3%；当提取液加入量为25 L时，茶叶、油菜、荞麦、芦丁、芝麻、益母草蜂花粉提取物的清除率分别为99.4%、95.3%、93.8%、92.1%、89.3%、86.2%。2.3 对DPPH自由基的清除作用DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基，呈紫色，在 515 nm处有强吸收，在有自由基清除剂存在时，DPPH的孤电子被配对，使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度变小，且这种颜色的变浅程度与配对电子数成化学计量关系。因此，可通过在此波长处吸光度的测定来评价自由基的清除情况。在0.025 mgmL DPPH自由基的

13、反应体系中，各种花粉溶剂提取物对DPPH自由基的清除能力如图3所示。由图3可见：5种蜂花粉甲醇提取物对DPPH自由基清除能力依次为油菜蜂花粉荞麦蜂花粉芦丁对照品茶叶蜂花粉芝麻蜂花粉益母草蜂花粉；在反应体系中加入10 L油菜、荞麦蜂花粉提取液，清除率分别为83.2%、80.3%，芝麻蜂花粉提取物对DPPH自由基的清除率为65.2%；随着花粉提取物加入量的增大，清除率也逐渐增大，当加入80 L时，荞麦、茶叶、油菜蜂花粉甲醇提取物的清除能力均在95%以上，芝麻蜂花粉清除能力也达93.3%，益母草蜂花粉的清除能力较弱，为88.2%，表明5种蜂花粉对DPPH自由基都有很强的清除能力。清除率/%荞麦蜂花粉

14、芝麻蜂花粉油菜蜂花粉茶叶蜂花粉芦丁对照品益母草蜂花粉加入量/ L图3 5种蜂花粉甲醇提取物对DPPH自由基的清除作用Fig. 3 Scavenging effects of five kinds of bee pollen extracts on DDPH2.4 对脂质过氧化的抑制作用脂质过氧化作为动脉粥样硬化的病因之一，可以启动某些引发动脉粥样硬化的反应，而在动脉粥样硬化发生发展的过程又会加重脂质过氧化反应。5种蜂花粉提取物对脂质过氧化体系的抑制作用结果见图4。由图4可知：5种蜂花粉提取物对其均有抑制作用，其抑制作用随提取物加入量增大而增强，油菜蜂花粉提取物对脂质过氧化体系的抑制作用最强，反

15、应体系中加入5L甲醇提取物时，抑制率为80%，加入60L时，抑制率达96.2%；荞麦蜂花粉对脂质过氧化体系的抑制作用最弱，加入5L时抑制率仅31.2%，加入60L时抑制率为65.4%；对脂质自由基的清除能力依次为油菜蜂花粉益母草蜂花粉芦丁对照品芝麻蜂花粉荞麦蜂花粉。荞麦蜂花粉芝麻蜂花粉油菜蜂花粉茶叶蜂花粉芦丁对照品益母草蜂花粉清除率/%加入量 /L图4 甲醇提取5种蜂花粉对脂质过氧化体系的抑制作用Fig .4 Antioxidative activity of five kinds of bee pollen extracts to Lipid peroxidation3 结 论1）本文仅对5

16、种蜂花粉甲醇提取的体外抗氧化活性进行了初步研究，蜂花粉已被应用于制造保健食品，其在体内的氧化作用有待进一步研究。2)蜂花粉中含有大量的黄酮类化合物和酚性化合物，这些化合物对蜂花粉抗氧化能力的贡献率值得进一步研究。3) 蜂花粉是较强抗氧化性的保健食品，有很大的开发前景。参考文献：1 方允中,郑荣梁. 自由基生物学的理论与应用M.北京：科学出版社，2002.2 张燕平. 天然蜂胶对自由基的清除作用J. 食品与发酵工业，2002，28(l)：48-52.3 王开发. 花粉营养成分与花粉资源利用M. 上海：复旦大学出版社，1993.4 庞战军，周 玫，陈 瑗. 自由基医学研究方法M. 北京：人民卫生出

17、版社，2000.5 HALLIWELL B，GUTTERRIDE J M C，ARUMOA O I. The deoxyribose method：A simple “Test Tube”assay for determination of rate constants for reactions of hydroxyl radical J. Analytical Biochemistry，1987,165：215-219.6 李小定，荣建华，吴谋成. 灰树花多糖PGF-1题外对羟基的抑制作用J. 食品科学，2003，24(7)：126-130. 7 张尊听，杨伯伦，刘谦光，等. 野葛根异黄酮

18、成分的超声萃取及抗氧化作用J. 食品科学，2002，23(5)：31-33.8 吕晓玲，朱惠丽，姜平平，等. 紫苏提取物抗氧化活性体外实验研究J. 中国食品添加剂,2003，(5)：22-25.（编 辑 张银玲）A study on the antioxidant action of bee pollen methanol extractsLI Tian，CAO Wei，SONG Ji-rong（Department of Chemicol Engineering, Northwest University, Xian 710069,China）Abstract: Aiming at the

19、further exploration of bee pollen resource, a study the antioxidant action of five kinds of bee pollen is made. The activity component was extracted with methanol through the method of ultrasonic wave. The antioxidant action of the activity component towards superoxidized anionic radical, hydroxyl radical, lipid radical and DDPH was tested. (The antioxidant action of the activity component was determined through the method of superoxidized anionic radical, hydroxyl r