无缝克隆,同源重组克隆

1、1.1.1 Gibson assembly简介(INTRODUCTION)原理：Gibson assembly是一种one step, one pot 的快速基因组装 方法。它只需要将基因片段和需要的三种酶混合在同一个管内在50 C下培养15-60 min就可以得到组装好的 DNA装配原理基于DNAt段间的重叠区域，过程依赖于三种酶：DNA外切 酶(T5 exonuclease),高保真 DN膘合酶。(Phusion polymerase) 和耐热DN旌接酶(Taq DNAigase )的共同作用。首先，T5核酸 外切酶消化DNA片段的链 方向是从5到3.每个DNAt段分别 形成一个单链的突出

2、部分，由于着这两个相邻的突出片段有一部分具 有同源性能够互补，所以 DNAt段退火，互补的序列重新配对连接。然后，在空缺的部分DN膘合酶以另一条DN婵链为模板，沿3方 向将对应的脱氧核甘酸连接到单链上，填补缺口。最后，连接酶将两Gaboon Assembly0K rWE如 Ell.Full,寓济*面。2d mAAdd k/Jgll% LuGibwn AssemblyMaster Mi宣incubate 闻 50pClo-i 15-60 mrillesOiA ou xulan曲a条DNA单链黏合起来，密封裂缝。这样具有重叠区域的DNAt段就组装成一整条DN砌子了。下面是组装的示意图 材料（MAT

3、ERIALS）试剂（REAGENTSNAD H2O ,1 M MgC2, 1 M DTT； 10 mM dNTP mix 1 M Tris-HCl pH , 50% PEG-8000 mg/ mL Tag ligase , g/ mL T5_ExO, Phusion（1 X）、LB培养基、抗生素（据载体而定）、LB平板（相应 抗性）实验前准备（SETUP于冰水浴中配制如下反应体系。如果不慎将液体粘在管壁，可通 过短暂离心使其沉入管底。4x isothermal assembly buffer20NAD mgH2O300 pL1MMgC2300 pL1MDTT300 pL10mMdNTPmix

4、600 pL1 M Tris-HCl pH3mL50% PEG-80003 mL加水到mL,每管分500 pL存于-20 C或-80 C冰箱，够3000 个反应2x assembly mix: best combination:100reaction1 mLmg/mLTag ligase10 pLwg/ mL T5_ExO100i LPhusion(1 x)25 pL4X.buffer500 口加水365 pL,存于-20 C冰箱，有效期1年。实验步骤( PROCEDURE1 .设计引物通过PCR勺方法在DNAt段的两端加上同源片段，NEBH 荐同源片段的长度为15-40 bp,同时要求这部分

5、对应的退火温度 高于4 C2 .进行DNA屯化：PCFT物进行琼脂糖电泳，胶回收。或者PCFT物 回收试剂盒回收。3 .进行重组反应，以20 pL反应体系为例：组分加入量Isothermal assembly Master Mix 10 L线性化载体10-100ng (1- 2 pL)8-补足至插入片段（3- 5X载体）Sterilized ddH 2O20 口50 C 反应 15-60 min4 .反应产物转化、涂板及克隆鉴定同传统分子克隆方法。针对性建议1 .在选择克隆位点时，应避免选择克隆位点上下游50 bp内有重复序列的区域。当克隆位点上下游 20 bp区域内GC含量士在40%- 60施围之内时，重组效率将达到最大。如这部分区域GC含量高于70%g者低于30%重组效率会受到较大影响。2 . Gi