重症监护病房老年患者耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的基因分析

1、重症监护病房老年患者耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的基因分析         10-09-09 15:37:00     编辑：studa20                      作者：周俊英 付有荣 郭清莲【摘要】  目的 为了解重症监护病房(ICU)老年患者感染耐甲

2、氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的分子流行病学特点、菌株的变异情况及耐药性。方法 采用KB法药敏实验、SCCmec多重PCR技术和ERICPCR技术对13株呼吸道感染老年患者MRSA进行分析，并运用NTSYSPC2.0对ERICPCR扩增产物结果进行聚类分析。结果 13株MRSA中，12株鉴定为SCCmecA型，1株鉴定为SCCmec型。13株MRSA的DNA同源性在44%到88%之间，同源性在69%以上可分为3类。结论 ICU老年患者感染的MRSA主要流行型为SCCmec IA型，但是并不存在聚集性人群感染发生。 【关键词】  耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；ERICPCR；多重PCR；

3、基因分型1961年英国报道了世界上第1株MRSA,其后大量不同克隆的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株出现并在全球播散1。MRSA 大多表现为多重耐药,不仅对内酰胺类抗菌药耐药,还常对喹诺酮类、氨基苷类和大环内酯类等抗菌药物耐药。万古霉素被认为是治疗MRSA感染的最后一道防线，但近几年又发现了对万古霉素耐药的MRSA2。这给临床治疗MRSA感染带来了很大困难。因此,对MRSA耐药性及流行病学研究对于正确治疗其引起的感染、防止其播散、及时控制其引起的暴发流行有重要意义。为此,我们对重症监护病房(ICU)老年住院患者分离的13株MRSA的分子流行病学特征及耐药性进行了研究，为临床防治MRSA

4、提供参考依据。1  材料与方法1.1  菌株来源 13株金黄色葡萄球菌均为2007年3月本院ICU呼吸感染的60岁以上老年患者。1.2  药敏试验 16种药敏纸片购于北京天坛生物制品生物药检定所，采用KB法，结果判读采用NCCLS2004年标准。1.3  MRSA检测 用苯唑西林(每片30 g)、头孢西丁(每片30 g)对13株金黄色葡萄球菌做药敏试验，当头孢西丁抑菌圈直径19 mm时判断为苯唑西林耐药，确定为MRSA；当抑菌圈直径20 mm判断为苯唑西林敏感，确定为MSSA。并用标准菌株金黄色葡萄球菌ATCC29213作质

5、控菌株，质控范围为2329 mm。1.4  引物序列 均由北京奥科生物有限公司合成，根据其合成参数均稀释为100 mmol/L浓度，其序列及产物大小见表1。表1  引物序列及产物大小（略）1.5  DNA模板制备 按实验室常规的酚/氯仿法提取。1.6  PCR扩增条件与反应参数 总反应体系为20 l，其中含DNA模板2 l、MgCl2 25 mmol/L为1.2 l引物ERIC1或ERIC2各为2 l、dNTP(10 mmol/L)1 l、10×PCR缓冲液2 l， DNA聚合酶(5 U/l)0.25 l(DNA聚

6、合酶购自上海生工公司，dNTP购自Promega公司)，无菌水9.3 l，以TE液代模板DNA作空白对照。温度设置：94预变性5 min；94变性1 min、52退火1 min、72延4 min共30个循环，最后72延伸8 min结束反应。1.7  SCCmec多重PCR 总反应体系为20 l，其中含DNA模板为2 l、MgCl225 mmol/L为1.2 l，dNTP (10 mmol/L)1 l、10×PCR缓冲液2 l、DNA聚合酶(5 U/l)为0.5 l(DNA聚合酶购自上海生工公司，dNTP购自Promega公司)，14种引物各为0.5 l、无菌水6.

7、3 l，以TE液代模板DNA作空白对照。温度设置：94预变性4 min；94变性30 s、53退火30 s、72延1 min共30个循环，最后72延伸8 min结束反应。1.8  扩增产物凝胶电泳分析 取5 l PCR产物，混合1 l加样缓冲液，点样在1.5%琼脂糖凝胶，电泳液为TBE缓冲液(0.1 mol/L TrisHCl、0.1 mol/L硼酸，0.002 mol/L EDTA， pH8.0)，电压为8 V/cm，溴芬兰至胶前端约1.52 cm处停止电泳。电泳完毕，将琼脂糖凝胶转移入含溴化乙锭（EB）的染液中，染色15 min后用净水冲洗15 min，然后凝胶成像仪紫外灯下观察并拍照记录结果。2  结  果2.1  纸片扩散法药敏试验结果 13株MRSA对加替沙星、庆大霉素、环丙沙星、红霉素、阿奇霉素、左氧氟沙星、克林霉素、苯唑西林和青霉素耐药率分别为83.3%、82.8%、80.6%、83.3%、88.2%、77.8%、88.3%、84.5%和100%。较敏感的四环素为90.4%，未发现耐替考拉宁和万古霉素的菌株。2.2  多重PCR扩增结果PCR扩增结果  见