芦笋类黄酮对巨噬细胞的影响

1、 芦笋类黄酮对巨噬细胞的影响朱立华，肖新燕, 许玉刚, 孙秀芬(聊城市第二人民医院，山东临清 252600)摘要 目的:探讨芦笋类黄酮对LPS激活巨噬细胞的影响,探讨其作用机制。方法：芦笋类黄酮以400µg/mL、200µg/mL、100µg/mL浓度处理脂多糖(LPS)激活的RAW264.7巨噬细胞,用Griess法、Elisa法测定培养液上清中NO的含量及IL-6的含量。结果：芦笋类黄酮400µg/mL可显著降低NO的生成量，100µg/mL、200µg/mL、400µg/mL均可显著降低IL-6的含量，并呈现剂量含量相

2、关性。结论:芦笋类黄酮可能通过抑制NF-B信号通路,从而降低LPS激活巨噬细胞NO及IL-6的生成量。关键词:芦笋； 巨噬细胞； NF-B信号通路中图分类号：R284.1文献标识码：A文章编号芦笋(Asparagus Officnalis Linne)学名石刁柏，又名龙须菜，属百合科(Liliaceae)植物，含有丰富的黄酮类化合物芦丁(Rutin)。类黄酮是药用植物中的主要活性物质之一。植物类黄酮类物质抗炎症机制的研究主要集中在抑制花生代谢途径中炎性介质的释放以及抑制MAPK信号通路产生炎性细胞因子两个方面1。LPS可以激活巨噬细胞NF-B，增加炎性细胞因子的释放2-3，本实验通过芦笋类黄酮

3、提取物作用于被LPS激活的巨噬细胞,通过检测对NO和IL-6的影响,初步探讨芦笋类黄酮的抗炎症机理。1材料与方法1.1实验材料1.2仪器和试剂Griess试剂(A+B) ；DMSO (二甲基亚砜) ，Sigma 美国；芦笋类黄酮，索氏提取法提取；IL-6 试剂盒，晶美生物工程(北京)有限公司；细菌脂多糖(Lipopolysaccharides LPS) ，北京夏斯生物公司；生物净化工作台 (AIR TECH) ，苏净集团安泰公司；倒置生物显微镜，OLYMPUS，Japan ；CO2培养箱，SANYO Electric Co.Ltd ；96 孔板，Orange Scientific ；微型旋涡混

4、合仪xw-80A，上海沪西分析仪器厂； HH-S数显恒温水浴锅，江苏省金坛市医疗仪器厂；BX-51 显微镜， OLYMPUS，Japan ； 立式自动电热压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；血球计数板XB-K-25， 国营上海医用光学仪器厂； 立式冷藏柜Electrolux，韩国LG公司； 电子天平FA1604S，上海天平仪器厂； 酶标仪BIO-RAD Model550，BIO-RAD，Japan。1.3实验方法 标准曲线的绘制 将亚硝酸钠(NaNO2)分别配成0、5、10、20、40、80(µmol/l)的浓度梯度,取100µL加入50µL的Griess试剂，反

5、应10min，490nm测光吸收值，求标准曲线及公式。 硝酸盐(NO)的测定4NO为一种自由基性质的不稳定气体，在体内、外均能很快生成亚硝酸基(NO2-)和硝酸基(NO3-)，故采用Griess法测定培养上清中的硝酸根和亚硝酸根作为衡量NO的指标。1.3.3 细胞培养及分组：将对数期巨噬细胞用DMEM培养液调整至 1×106 /L浓度接种于96孔培养板，每孔100 L, 37, 50 mL/L CO2培养箱中培养。培养24小时后，扣掉培养液，向各孔加入新鲜培养液120µL，然后加入120µL含索氏提取物的培养液使终浓度分别分别为400、200、100µg

6、/mL，LPS终浓度5µg/mL，并设终浓度为5µg/mL LPS组，以及5µg/mL LPSDMSO、空白组作为对照，除空白组外各组DMSO浓度保持一致为0.4%。37，50 mL/L CO2培养箱中培养48小时，取上清备用，20保存。1.3.4 细胞因子测定ELISA检测IL-6：每孔加IL-6标准品/样品100L，密封，37孵育1h，加100L生物素化的抗体，密封，37孵育1h，洗板5次，加100L链酶亲和素化的HRP溶液，密封，37孵育0.5h，洗板5次，加100L TMB底物溶液，37孵育20min，加100L终止液，终止反应，450nm测定光吸收。 数

7、据处理数据采用SPSS12.0、Microsoft Office Excel 2003软件对数据进行统计分析。2结果与分析2.1制标准工作曲线以亚硝酸钠(NaNO2)mol/mL为横坐标，以吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线，对所做的数据进行回归分析，得回归方程为y0.0064x0.0041，相关系数R20.999，如图 1。图1 光吸收值标准工作曲线 2.3芦笋类黄酮巨噬细胞NO的影响统计表明：空白组与LPS组相比差异显著(P<0.05)，LPS组和 LPS+DMSO与 400 µg/mL相比差异都显著(P<0.05)。见图2图2 芦笋类黄酮对巨噬细胞NO的影响2.4

8、芦笋乙醇提取物对巨噬细胞IL-6含量的影响LpsDMSO与各浓度处理组相比均可显著降低IL-6含量(P<0.05)。见图3图3 芦笋提取物对巨噬细胞IL-6含量的影响3讨论已有研究成果表明LPS可以激活巨噬细胞NF-B，增加炎性细胞因子的释放，类黄酮可以抑制此通路，降低炎性细胞因子iNOS、NO、IL-6、TNF-的释放5-8，iNOS是比较重要的炎性细胞因子，而一氧化氮(NO)含量可以间接的表明iNOS的含量。有研究发现，芦笋对细胞免疫系统功能有较强影响。本实验选取RAW264.7作为研究对象，巨噬细胞在吞噬和刺激时活化，释放NO自由基，作为外来入侵微生物和肿瘤细胞的毒性因子。但NO作

9、为自由基还会损伤正常细胞，在炎症生成方面起到重要作用。iNOS和IL-6以及TNF-具有相同的启动子，所以NO的含量的变化趋势可能间接的反映出IL-6、TNF-的变化趋势。实验结果显示：芦笋类黄酮400µg/mL可以显著降低由LPS诱导的NO含量的增加，芦笋类黄酮对巨噬细胞的实验中400µg/mL及以上浓度可显著降低NO含量的增加，而对于IL-6各实验浓度都可显著降低其浓度。这说明芦笋类黄酮可显著降低由LPS诱导的巨噬细胞NO含量、IL-6含量的增加，即可以抑制巨噬细胞释放炎性细胞因子iNOS、IL-6。炎性细胞因子中IL-6、IL-1beta、IL-8、TNF-等均在转录

10、水平上为NF-B/Rel所控制，核因子-B(NF-B)是调控炎症细胞因子基因表达的主要转录调控因子之一，在创伤后的炎症反应中发挥着重要的作用。本实验中芦笋类黄酮可同时降低LPS激活巨噬细胞NO及IL-6的生成量与实验报道一致，其可能的作用机制是抑制NF-B信号通路。参考文献：1 Hyun Pyo Kim, Kun Ho Son，Hyeun Wook Chang, etal. Anti-inflammatory Plant Flavonoids and Cellular Action MechanismsJ. J Pharmacol, 2004, Sci96: 229-245.2 Wadswor

11、th TL, Koop DR. Effects of Ginkgo biloba extract (EGb 761) and quercetin on lipopolysaccharide-induced release of nitric oxide. Chem Biol Interact. 2001, 137: 43-58.3 Chung CP, Park JB, Bae KW. Pharmacological effects omethanolic extract from the root of Scutellaria baicalensis an its flavonoids on

12、human gingival fibroblast. Planta Med 1995, 61: 150-153.4 张均田主编. 现代药理实验方法M,下册. 北京: 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社. 1998, 2121-38.5 Shen SC, Lee WR, Lin HY, Huang HC, Ko CH, Yang LL, et al.In vitro and in vivo inhibitory activities of rutin, wogonin, and quercetin on lipopolysaccharide- induced nitric oxide and

13、 prostaglandin E2 production. Eur J Pharmacol. 2002, 446: 187-194.6 Higa S, Hirano T, Kotani M, Matsumoto M, Fujita A, Suemura M, et al. Fisetin, a flavonol, inhibits TH2-type cytokine production by activated human basophils. J Allergy Clin Immunol.2003, 111: 12991306.7 Chang CJ, Geahlen RL. Protein

14、-tyrosine kinase inhibition: mechanism-based discovery of antitumor agents. J Nat Prod.1992, 55: 15291590.The research of influence of Asparagus Officinalis extraction to LPS stimulated macrophageZhu Li-hua, Xiao Xin-yan ,Xu Yu-gang ,Sun Xiu-fen(The Second Peoples Hospital of LiaoCheng LinQing LiaoC

15、heng 252600)Abstract Objective:To study the influence of Asparagus Officinalis extraction to LPS stimulated macrophage and approach its mechanism of action.Methods: 400µg/mL, 200µg/mL, and 100µg/mL extractions effects on LPS stimulated macrophage RAW264.7 with Asparagus Officinalis ex

16、traction, Griess method and Elisa method are used in the determination of NO release and content of IL-6 in LPS stimulated macrophage RAW264.7.Results: the extraction process in 400µg/mL can reduce NO release notability, and 100µg/mL、200µg/mL、400 µg/mL can reduce content of IL-6 notability in