观察分析不同环境因素对小鼠应激反应的作用.docxVIP

1、.论著*观察分析不同环境因素对小鼠应激反应的作用周小江，邵青，张新创(兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃省疫苗工程技术研究中心，兰州730046)摘要：目的观察小鼠在领用、运输过程中的环境变化引起的小鼠应激反应，并根据体重变化、蔗糖水偏嗜度变化、旷场行为得分来分析小鼠应激反应对机体产生的影响。方法SPF级BALB/c、IH、KM小砒随机分为试骑组和对照组，在模拟外部5种剌激试验后，记录体或、蔗糖水和纯水消耗量并计算出蔗糖水偏嗜度、旷场活动数据°结果3种小鼠试验组在刺激后的体重比对照组明显减轻;旷场活动计数有相对应的变化;试验组蔗糖水偏嗜度比对照组下降明显，结果均有统计学意义(P<

2、;0.05)o结论研究初步表明试验前的应激刺激会影响实验小鼠的精神状态。关键词：应激;动物福利；蔗糖水偏嗜度;旷场实骑中图分类号：Q958.11文献标志码：A文章编号：1005-5673(2013)02-0033-04ObservationandanalysiseffectfromdifferentenvironmentalfactorsonthestressresponseinmiceZHOUXiao-jiang,SHAOQing,ZHANGXinYhuang(LanzhouInstituteofBiologicalProductsCo.Ltd,CerUerforGansuProvincia

3、lVaccitieEngineeringResearchtIxinzhou730046,China)Abstract:ObjectiveTheobservationwascarriedoutontheeffectofenvironmentalchangesuponmiceduringreceptionandtransportationofthem.andtheintensityofthestressresponseinmicewasanalysedbasedonchangeinbodyweight,changeinaddicteddegreeforpreferencetosucroseandt

4、hescoresbyopen-fieldbehavior.MethodsTheBALB/c,NIH,KMmiceinSPFlevelwererandomlydividedintoexperimentalandcontrolgroups,respectively,recordedingbodyweight,consumptionofsucrosewaterandpurewater,preferencetosucrose,anddatafromopen-fieldactivityafterthefiveexternalstimulativetestsweresimulated.ResultsHie

5、bodyweightsofmiceafterstimulationinthreetestgroupsaresignificantlylowerthanthoseinthecontrolgroup,andthecorrespondingchangesoccurredinthescoresofopen-fieldactivityandthesucrosepreferenceintestgrouparesignificantlydecreasedincomparisonwiththoseinthecontrolgroup,andthedifferencesarestatisticallysignif

6、icant(P<0.05).ConclusionInthisstudythestressstimulationoccuredbeforethetest,whichwillaffectthementalstateoftheexperimentalmice.Keywords：Stress;Animalwelfare;Sucrosepreference;Open-fieldtest随着中国实验动物饲养管理标准化程度的提高，实验动物饲养环境不断得到改善,SPF饲养设施广泛应用到实验动物行业中，为实验动物的质量提供了保证。但由于在实验动物从运输到试验前的过程中受外界多种因素的影响，会引起实验动物的

7、应激反应,导致实验动物行为发生变化，影响实验动物在试验中的试验数据。收稿日期：2012-12-03；修回日期：2013-0116作者简介:周小江(1968-).男.医学生物程师，主要从事实验动物微生物检测工作C应激(Stress)是机体对不协调状态或环境稳定受到威胁时所做出的反应。一般伴有神经、内分泌、免疫和行为的变化来完成身体对应激的应答。目前，国内对实验动物在离开动物饲养设施到动物试验前这一过程中所产生的一系列应激反应越来越受到关注。有文献报道实验动物在外界应激刺激后，对实验动物自身的免疫系统存在着干扰，从而影响动物试验的结果，'51o通过实验室模拟动物运输、外界温湿度变化以及人为

8、不规范操作等因素引起的应激,在体重、蔗糖偏嗜度、旷场行为试验的数据变化来观察实验动物从离开动物饲养设施到试验前这一过程的应激程度，确定对实验动物机体的影响。同时通过实验室模拟外界环境因素变化的方法，避免了不确定因素的发生和干扰，有利于观察和研究单一因素对实验动物的影响,旦存在着从试验项目设计、易于操作和控制、人为干扰因素少等优点，为在这个领域的研究提供一些参考数据和试验方法。1材料和方法11材料1.1.1实验动物SPF级BALB/c、NIH、KM小鼠均获自兰州生物制品研究所有限责任公司（以下简称兰州公司）实验动物室，生产许可证号:SCXK（甘）2012-0001,使用许可证号:SYXK（t）-

9、）2012-0002o1.1.2天平、摇床、批筒、孵育箱、冰箱等均为兰州公司实验动物室检测组常用设备，均经甘肃省气象计最检定站校验合格。1.2试验方法1.2.1称重方法将SPF级BALB/c、N1H、KM小鼠分别设置为试验组和对照组,每蛆随即挑选1。只小鼠，雌雄各半。体重称重时间为:首次:两组小鼠称取体重;剌激前：72h蔗糖水、纯化水双瓶适应性饲养后，称取体重;刺激1:禁食禁水18h后称取体重;刺激2：蔗糖水、纯化水双瓶饲养24h后试验组进行模拟五项刺激试验，对照组正常饲养后称取体重;刺激3：重复刺激2试验称取体重；刺激后:重复刺激2试验称取体重;恢复后:停止刺激并蔗糖水、纯化水双瓶饲养72h

10、后称重。1.2.2糖水偏嗜度试验力将两组小鼠进行72h蔗糖水、纯化水双瓶适应性饲养。蔗糖水浓度为1%;纯化水为兰州公司培养基室制作，为防止小鼠对蔗糖水的依赖性，每12h两种水交换位置。刺激试验前禁食禁水18h,五项刺激试验开始，加入蔗糖水、纯化水分别为100mL双瓶饲养。剌激试验72h后通过量筒计量糖水、纯化水消耗量并计算出糖水偏嗜度（%）。糖水偏嗜度（%）=糖水消耗量/（糖水消耗量+纯化水消耗量）x100%o1.2.3旷场行为试验旷场（Openfield）试验箱为兰州公司自制木箱，根据小鼠身长其设计大小为40cmx40cmx30cm,内外均为黑色，用白线平均分为25个方格的旷场箱。计分方法:

11、试验期间观察动物每走一格为1分，双足离地站立为1分，前爪整理毛发为I分，爬墙一次为1分，记录时间为3min。1.2.4模拟外界五项刺激试验固定试验:将试验动物固定在自制的固定板，时间为3min,要求不能损伤小鼠四肢，固定背部;晕车试验:使用设备为实验室常规用摇床,生产厂家为:海门市其林贝尔仪器制造有限公司，型号:TS-2。摇床设置为每分钟晃动100次，晃动3min；严寒试验：-20°C冰柜内放置3min；酷热试验：30T孵育箱放置3min；浸湿试验:烧杯内盛适屈室温纯化水，浸湿3次。以上试验每天进行2次,直到刺激试验结束。1.2.5恢复试验将试验组和对照组小鼠,在刺激试验结束后,进行

12、相同方式（蔗糖水、纯化水双瓶）饲养3d,然后测定体童、蔗糖水偏嗜度、旷场行为数值。1.2.6统计学处理采用SPSS统计学软件16.0进行统计分析，全部数据以土s表示,组间差异比较采用七检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1BALB/c小鼠试验前试验组、对照组平均体重分别为13.62g、13.34g;试验后试验组、对照组平均体重分别是19.18g、20.22g；恢复3d平均体重试验组、对照组分别为23.24g和24.12g（见图1）。旷场行为计数如表1所示，试验前和恢复3d后两组问数值无显著性差异，试验后两组间数值差异有统计学意义（P<0.05）；蔗糖偏嗜度结果如表2

13、所示，试验前和恢复3d后两组间数值无显著性差异，试验后两组间差异有统计学意义（PvO.05）o图1BALB/c、NIH、KM小鼠体重Fig.IThebodyweightofBALB/c,NIHandKMmice2.2NIH小鼠试验前试验组、对照组平均体重分别为16.56g、16.58g;试验后试验组、对照组平均体重分别是22.13g、23.12g；恢复3d后平均体重试验组、对照组分别为21.38g和24.74g（见图1）。旷场行为计数如表1所示,试验前、后两组间数值无显著性差异，恢复3d后数值有显著性差异（P<0.05），分析NIH小鼠在感受刺激方面有一定延迟性表现，试验后数值未出现差异

14、，但精神状态表现为胆怯、易惊吓等;蔗糖水偏嗜度结果如表2所示，试验前和恢夏3d后两组间数值无显著性差异，试验后两组间差异有统计学意义（P<0.05）。2.3KM小鼠试验前试验组、对照组平均体重分别为18.38g、18.18g;试验后试验组、对照组平均体重分别是23.82g、26.10g；恢复3d后平均体重试验组、对照组分别为30.00g和30.08g（见图1）。旷场行为计数如表1所示，试验前两组数值无显著性差异，试验后和恢复3d后数值均有显著性差异（P<0.05）；蔗糖水偏嗜度结果如表2所示，试验前和恢复3d后两组间数值无显著性差异，试验后两组间差异有统计学意义（尹<0.05

15、）。表1旷场试验结果Tab.1Theresultsofopen-fieldtestBALB/cNIHKMx±s*为P<0.05试验组对照组试验组对照组试验组对照组试验前41±3621±17106±37134±2072±3284±42试验后46±4083±22*103±6391±6031±30127±5*恢复后75±4145±2759±41118±32*38±2887±57表2蔗糖水由度试验结果Tab.

16、2Thedataofsucrosepreference*为P<0.05X±3BALB/cN1HKM试验组对照组试验组对照组试验组对照组试验前0.51±0.200.61±0.140.63±0.060.60±0.050.70±0.120.65±0.02试验后0.46±0.120.57±0.07*0.57±0.050.64±0.08,0.68±0.040.75±0.06*恢复后0.54±0.110.63±0.100.64±0.040.6

17、3±0.120.71±0.040.72±0.083讨论试验通过模拟外界不良因素来诱导小鼠焦虑、恐慌、萎靡、胆怯等精神症状,测定小鼠从离开动物饲养设施到试验场所试验前的刺激强度，探讨减轻外界因素刺激小鼠的必要性，并为改善这一过程的刺激强度，提供了一定的参考数据。在模拟外界刺激因素的试验方法时，借鉴了文献8中的一些想法，并且通过在实验室模拟一些特殊形式比如短途运输造成的颠簸、晕车、温湿度急剧变化、饲喂动物时漏水等因素设计出晕车试验、严寒试验、酷热试验和浸湿试验，设计时间均为3min,比实际因素时间要短，但通过每天2次试验来完成对现实中应激因素的模拟，同样达到了预期目的

18、。根据表1所示,SPF级别3种小鼠在旷场行为试验中，数据变化复杂，虽然BALB/c和KM小鼠对照组数据变化不稳定（口J能与试验的计分方法有关，有必要在今后试验中继续探索改进），但从试验组小鼠试验后行为表现为弓背行走,对声响敏感的恐惧、胆怯症状来看，与对照组小鼠旷场内表现出的悠闲、探索行为有明显外观差异，数据结果差异有统计学意义（P<0.05）。经过模拟5项试验刺激，试验组体重比对照组体重明显减轻，且差异性趋势越来越显著。而经过3d恢复,差异性趋势逐步减缓，证明试验小鼠在一定应激刺激后，如果有良好的饲养管理，在一定的时间内,体重会有程度不同的恢复。经统计学分析，糖水偏嗜度试验组与对照组数据

19、存在显著性差异（P<0.05）。试验中试验组小鼠在模拟外界五种刺激试验后,对糖水的偏好降低，说明缺乏快乐感受，对饲养过程中蔗糖奖赏的获取欲望减弱，表现出萎靡，恐慌、胆怯等精神症状。在经过3d恢复饲养试验后，蔗糖水偏嗜度试验组与对照组有接近的趋势，恢复饲养对小鼠应激剌激有恢复作用。综上所述，SPF级BALB/c、NIH、KM小鼠在刺激试验前后行为学指标发生相应变化，试验组小鼠在各种刺激试验后精神状态变差，与对照组有比较明显的行为差异，而这种差异可能影响试验小鼠在未来试验中的实验结果。SPF级小鼠是生活在SPF饲养设施内的实验动物，饲养环境稳定,饲养人员固定，饲养管理有严格的国家标准控制，而

20、在离开SPF饲养设施后，外界未知因素增加，这些因素有可能导致小鼠短时间内产生应激反应。为了确保实验动物在试验前减少或降低外界因素的影响,应在动物领用、运输和人员操作推行标准化管理，包括对动物运输中的运输工具、包装盒、垫料、食物、饮水、恒温、恒湿的综合性要求。而在恢复试验中，通过正常的饲养，发现3种小鼠在体重、糖水偏嗜度和旷场行为数据中都有一定程度的恢复，表明如果在一个相对稳定环境中进行恢复性饲养，可以减轻应激刺激带来的不良影响。参考文献1GB14925-2010,实验动物环境及设施S.2 MobergCP.MenchJA.动物应激生物学M.北京：中国农业出版社,2005:28-41.3 Rey

21、esTM,WalkerJRDeCinoC.ela.Categoricallydistincta-cutestressorselicitdissimilartranscriptionalprofilesintheparaventricularnucleusof(hrhypothalamusJ1.Ncurwci.2(X)3,(23):5607-5616.'4SgoifoA,PozzatoC,MeerioP,etal.Inlrnnittentexposuretosocialdefeatandopen-fieldtestinrats:acuteandlong-termeffectsonE(；(

22、；,bodytemperatureandphysicalactivityJ.Stress,2002,5(1):23-35.5,DeCarutR,AsnisGM.Thenon-steroidalanti-inflammatorydrugdiclofenacsodiumattenuatasIFN-alphainducedalterationstomonoamineturnoverinprefrontalcortexandliippocampus(J.BrainResearch,2003,977(1)：70-79.6j施桂兰，库宝善，姚海燕.解郁丸对慢性应激大W.HPA轴和免疫系统的影响J.中国中药杂志,2007.32(15):1553-1554.L7BrenesSaenzJC,VillagniOR,FoniagueraTJ.Factoranalysisofforcedswimmingtest,sucrosepreferencetestandop