肿瘤细胞冻存方法的探讨

1、肿瘤细胞冻存方法的探讨曾艳1,付浩2,韦星呈1,师秀艳2(1.沈阳医学院医学基础部免疫学教研室,辽宁沈阳110034; 2.生物化学教研室关键词肿瘤细胞;瘤株;冻存中图分类号R73-35文献标识码B文章编号1008-2344(200602-0156-01肿瘤细胞的培养是开发新的抗肿瘤新药的常规手段。肿瘤研究中移植性肿瘤又称瘤株传代也是最基本的常用技术。瘤细胞培养后和瘤株建成后如何将细胞系和瘤株保存好是很值得探讨的。现将我们摸索出一套简便易行、冻存效果好的肿瘤细胞冻存方法报道如下。1冷冻保存时间与肿瘤细胞存活率的关系实验室得到一个新的肿瘤细胞株后,首先要把该肿瘤细胞株培养扩增后冻存起来。肿瘤细胞

2、冻存可以在由于污染等情况丢失细胞时有备份可用,另外几乎所有肿瘤细胞在培养传代的过程中发生一定程度的变异,为了保持实验结果的一致性,一般肿瘤细胞在培养几十代以后就不能使用了,因此需要将冻存的、传代较少的肿瘤细胞复苏培养再使用。冷冻保存温度指能长期保存细胞的超低温度,在此温度下,细胞生化反应极其缓慢甚至停止,但经过长期保存,在复苏后仍能保持正常的结构和功能。不同的细胞和生物体以及使用不同的冷冻保存方法要取得同样的冷冻保存效果,冷冻保存温度可以不同1。但从实际和效益的观点出发,液氮温度(-196是目前最佳的冷冻保存温度。在-196时,细胞的生命活动几乎完全停止,但复苏后细胞的结构和功能完好。如果冷冻

3、过程得当,一般生物样品在-196下均可保存十年以上。应用-70 -80保存细胞,短期内对细胞的活性无明显影响,但随冻存时间延长,细胞存活率明显降低。在冰点到-40范围内保存细胞的效果不佳2。我们采用冷冻保存培养瘤细胞和瘤株已有近10年的经验,我们观察了已冻存的1年、2年、5年及8年以上的瘤细胞和瘤株,不同冻存条件对其存活的影响,发现存放细胞并不是无限期的,在液氮中保存细胞随着保存年数的增加,细胞存活率下降。5年时细胞存活率仅为40%55%,所以每5年最好重新将种子细胞复苏后扩增再冻存,以确保种子细胞的存活率。2肿瘤细胞冻存方法的改进冷冻保存瘤细胞和瘤株要比体内、体外传代保存更为优越,瘤细胞冻存

4、后几乎没有机械性损伤,可以使培养瘤细胞和瘤株免遭污染和受宿主不同因素影响而改变生物学特性,特别对于那些不常用的但又很重要的细胞系或刚建株后不能立即用于实验的细胞系及瘤株,低温保存更为重要。在低于-70的超低温条件下,有机体细胞内部的生化反应极其缓慢,甚至终止。因此,采取适当的方法将生物材料降低至超低温,即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老死亡。当以适当的方法将冻存的生物材料恢复至常温时,其内部的生化反应可恢复正常。所谓冷冻保存,就是将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中,以一定的冷冻速率降至零下某一温度(一般是低于-70的超低温条件,并在此温度下对其长期保存的过程。我们冻

5、存细胞时将所需冻存的细胞加入冻存液后直接置于-70冰箱中过夜,第2d放入液氮中。传统常规的细胞冻存方法需要将冻存的细胞置于42h,04h,-20过夜,次日取出悬挂液氮罐口30m in后,下降到液氮中保存3。常规细胞冻存方法有许多弊端:当冷冻速度过慢时,细胞脱水严重,细胞体积严重收缩,超过一定程度时即失去活性。还会引起细胞外溶液部分结冰,从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高,产生溶质损伤。同时冷冻速度不同也能使细胞内发生不同的生理变化,可以对细胞产生不同的损伤。因此,超快速玻璃化冷冻对细胞存活来说是最为理想的冷冻方法。细胞内外呈玻璃化凝固,无冰晶形成或形成很小的冰晶,对细胞膜和细胞器不致造成损

6、伤,细胞也不会在高浓度的溶质中长时间暴露而受损。不同细胞的最适冷冻速率不同。我们的细胞冻存方法与传统的常规细胞冻存方法比较而言,省时、省力、简便易行,更为重要的是细胞冻存效果好。对短期(数周或数月不用的细胞可保存于-70低温冰箱中。但暂时存放时间不宜过长,因1年存活率仅为34%,若要长期保存还应放入液氮罐中。由此可见,要想获得冻存细胞的最大活性,影响因素很多,它们相互影响,相互作用,无论那一方面均不可忽视。如何更好的长时间冻存细胞又能保存其活性还有待进一步探讨。参考文献:1王丽英,于鸿.不同种类细胞培养和冻存方法的改进J .实用肿瘤学杂志,1998,12(1:12.2薛庆善.体外培养的原理和技

7、术M .北京:北京科学出版社,2001.128-136.3龚守良.实用基础医学实验技术M .吉林:吉林科学技术出版社,1990.233-245.收稿日期2005-10-09阿霉素微乳的制备方法孟俐丽1,王俊平2 (沈阳医学院科研处,辽宁沈阳110034;21医学基础部药理教研室关键词长循环阿霉素微乳;急性毒性;抗癌作用中图分类号R965文献标识码B 文章编号1008-2344(200602-0157-02阿霉素(doxorubicin,DR 是一种蒽醌类抗生素,用于治疗肿瘤,但不良反应多且严重1。乳剂中分散微粒大小介于50100nm ,透明或半透明液体的乳剂称为微乳(m icr oe muls

8、i on ,可作为一种抗癌药物新剂型。微乳可用于运载抗癌药物,能够显著提高药物的抗癌作用,同时减轻或减少其不良反应2,3。为减轻DR 的不良反应,同时提高其疗效,我们采用油酸为相,聚乙二醇2二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(PEG 2DSPE 为乳化剂,研制阿霉素微乳(doxo 2rubicin m icr oe mulsi on,DR 2M ,初步评价其急性毒性和抗癌效果。1材料与方法1.1材料阿霉素:由海门制药厂生产;鸦胆子油,由沈阳药科大学制药厂提供;PEG -DSPE,购自美国Avanti Polar L i p ids 公司;昆明种小白鼠,雌雄各半,体重(20±2g,艾氏腹水癌(E

9、AC ,Hep s 腹水型,由课题组所在单位提供;日本岛津高效液相色谱系统,S LC 26A,附SP D 2G AV 型全波长紫外检测器;国产RE52298型旋转蒸发器;国产FSH 22A 可调高速匀浆机;国产S LJ 21型离心机。1.2阿霉素微乳的制备制备阿霉素(DR 和油酸(OA 的复合物(DR 2OA ,与PEG 2DSPE (PEG 分子量:2000一起溶于氯仿,然后采用旋转蒸发器制备脂质薄膜。在50的水浴中,将上述脂质薄膜用10%葡萄糖水合20m in,转入冰浴中,用高速匀浆机分散5m in,100n m 微孔滤膜过滤,即得阿霉素微乳。1.3阿霉素的分析方法采用HP LC 测定DR

10、 含量,色谱条件是在文献报道的基础上,结合我们的仪器条件而建立的3浆中DR 的提取”项下程序处理样品,提取上述标准样品中的DR 。在上述色谱条件下,测定所提取的DR 的峰面积。以峰面积为纵坐标,血浆中DR 浓度为横坐标X,进行线性回归,得HP LC 测定血浆中DXR 的标准曲线方程:Y =169.96+6508.21X ,r =0.9992。血浆中DR 的平均回收率为87.97%,精密度不超过4%。1.4血浆中DR 的提取采用提取后测定法测定DR 的血浆药物浓度。提取方法参考文献方法1。取样条件:6mg DR /kg 动物,静脉注射单剂量给药,于不同时刻取3只动物断头采血,置肝素抗凝的干燥试管中,按如下程序提取DR:取血浆0.6m l 与0.6m l P BS (pH =9.1