胚胎不同器官的细胞连接蛋白基因表达研究

1、    胚胎不同器官的细胞连接蛋白基因表达研究        【摘要】目的探索胚胎不同分化阶段、不同器官中细胞连接蛋白基因的表达规律及其与细胞分化的关系。方法采用Connexin系列基因探针，通过Northern印迹法，对不同胎龄的不同胚胎器官中Cx基因表达状态进行了研究。结果(1)胚胎期肝、胃、肺、肾等器官中Cx31、Cx46、Cx31.1不表达。(2)胚胎不同发育阶段连接蛋白基因呈不同表达状态。如Cx26、Cx43在3个月胎龄的肝脏中高度表达、Cx32从第5周至第5月都呈

2、高度表达；(3)连接蛋白基因表达有器官差异性，肝Cx32、胃Cx37、肺Cx40和肾Cx43基因高度表达。(4)连接蛋白基因在各器官中表达又有交叉性，Cx26在上述肝、胃、肾等器官中呈不同表达状态。(5)细胞连接蛋白基因的表达状态与组织细胞的分化基本一致。结论它们可能是调节胚胎组织分化、细胞增殖及形态发生过程中某些分化事件的关键性候选基因。【关键词】连接蛋白基因表达胚胎EXPRESSION OF CONNEXIN GENES IN VARIOUS ORGANS OF EMBRYOZhang Jianxiang， Li Guiyuan， Zhang Xiaohui(Department of H

3、istology and Embryology Hunan Medical University,Changsha)【Abstract】 Objective In order to investigate the relationship between the expression regulation of Cx genes and cellular differentiation in various organs during embryonic development.Methods Using connexin genes Cx26,Cx31,Cx31.1,Cx32,Cx37,Cx

4、40,Cx43 and Cx46 as the molecular probes,the Northern blot hybrydization was done,we studied the expression level of Cx genes in different stages of embryonic organs.Results Conclusion Cx gene might be a key condidate gene to regulate some differentiational events associated with cellular differenti

5、ation,proliferation,morphogenesis in early embryo.【Key Words】 Connexin； Gene; Expression; Embryo通过缝隙连接蛋白(connexin,Cx)分离及其基因克隆，现已发现连接蛋白基因(connexin genes)是一个有10多个成员的超基因家族1。缝隙连接在胚胎发育早期就存在，它们对胚胎细胞分化、形态发生及生长调控起重要作用2；在成体组织和体外培养的细胞，它们与细胞分化密切相关3。Cx基因的表达状态决定了细胞缝隙连接通道的形式、连接通讯通道的形态结构和数量、也决定了通讯通道消亡。Cx基因的表达对细胞诱导

6、、分化、增殖、细胞程序性死亡及衰老等生物过程有着十分密切的关系。胚胎早期，神经系统和循环系统尚未建立或未发育完善，长距离信息传递难以进行。要使胚胎细胞向各种组织器官分化，离不开细胞间化学信息的交换。在个体发育1216h的桑葚胚期即可见缝隙连接形成，但它随胚胎发育而经常发生动态变化。鸡胚发育2036h，外胚层细胞间有密集的细胞缝隙连接，至48h，缝隙连接逐渐减少，而桥粒变得明显4。Warner等5将细胞连接蛋白抗体注入非洲爪蟾8细胞期早期胚胎，以阻断通讯通道；结果注射过抗体的卵裂球的发育出现明显的区域性形态缺陷现象：脑和眼发育不良或完全缺失，这些缺陷可能是直接阻断了控制局部分化的信息传递而造成的

7、。从而提供了第一个关于缝隙连接在早期胚胎发育中起重要作用的直接证据，表明连接蛋白基因表达可能是细胞生长调控和器官发育过程中某些分化事件的关键性候选基因。为了探索胚胎发育过程中不同器官不同分化阶段的细胞连接蛋白基因的表达规律及其与细胞分化的关系，本研究采用Cx基因系列作为分子探针，通过Northern印迹法，对不同时期胚胎肝、肾、肺和胃的Cx基因表达状态进行了研究。材料和方法1. 材料收集胚胎标本28例；其中5周、6周各5例，35个月各6例，母体健康；取胚胎肝、胃、肺、肾等组织块置于液氮中贮存。胎龄按月经龄减2周计算。2. DNA探针的制备2.1质粒DNA的抽提：分别将8种携带pCx质粒及内对照

8、pGAPDH质粒的细菌小量复苏后，划琼脂平皿，37过夜培养。次日挑取单个克隆进行小量扩增，采用碱裂解法快速提取质粒，用相应的内切酶消化鉴定。鉴定确认后的克隆进行大量扩增和抽提质粒DNA6，质粒资料见表1。(所用质粒均由本校肿瘤研究所李桂源教授从美国带回，惠赠)。表1所用质粒资料一览表Table 1 A list of plasmids containing Cx cDNA质粒plasmids载体vectors限制性内切酶restriction enzymes插入片断(kb)inserts(kb)种属species质粒Cx26(pCx26)pSG5BamH0.68人(human)质粒Cx31.1

9、(pCx31.1)SP63TBg1 0.85小鼠(mouse)质粒Cx32(pCx32)pGEM3EcoR 1.5大鼠(rat)质粒Cx33(pCx33)SP64TBg1 0.9大鼠(rat)质粒Cx37(pCx37)SP64THind /Xba1.25小鼠(mouse)质粒Cx40(pCx40)pGEM4zEcoR /Xba1.1小鼠(mouse)质粒Cx43(pCx43)pSG5BamH1.11人(human)质粒Cx46(pCx46)BSK+EcoR 1.6人(human)内对照质粒(pGAPDH)/EcoR /Hind 0.6人(human)   

10、0; 2.2质粒DNA内切酶消化和片断回收：以1g DNA与23IU内切酶的比例，37，6090min消化质粒，然后在1%的琼脂糖凝胶上电泳分离。于紫外灯下观察，并切下插入目的片断的DNA，用低熔点琼脂糖法和Glass MAX(GIBOL-BRL公司)试剂盒回收、纯化。测OD值确定浓度，4贮存备用。 3. 胚胎组织细胞总RNA抽提胚胎组织细胞总RNA抽提程序：分别将贮存于液氮中的不同发育时期肝、胃、肺、肾组织块经单细胞制备仪制成单细胞，细胞总RNA的提取按异硫氰酸胍-酚-氯仿一步抽提法制备。具体步骤如下：在冰上按每107细胞加1ml裂解液(包括4mmol/L)异硫氰酸胍，0.5%十二烷基机氨酸

11、钠，0.1mmol/L -巯基乙醇)裂解细胞；收集裂解液于50ml离心管中，分步加入并混匀1/10体积2mmol NaAc(pH4.0)，等体积水饱和酚、1/5体积氯仿-异戊醇(491)；冰浴15min后，于4，10 000g离心20min，取上清加等量异丙醇，-20静置1h，4，10 000g离心10min弃上清，将沉淀重溶于0.5ml裂解液，再用等体积异丙醇沉淀1次，经75%酒精洗涤，空气干燥，溶于适量的DEPC处理水中。RNA浓度经分光光度计测定。4. Northern杂交4.1RNA电泳和转膜：每道20g RNA，在1%琼脂糖甲醛变性凝胶上50V电泳4h，用DEPC处理水淋洗凝胶数次，

12、20×SSC浸泡45min，采用纸巾转移法将凝胶中的RNA转移至尼龙膜上，1.6 J/cm2紫外线交联固定。4.2探针标记：取回收的质粒DNA片断，以-32PdCTP(北京亚辉生物医学工程公司)为标记物，用随机引物标记盒(Promege公司)标记探针。50l反应体积中包括：模板DNA50ng，1×标记缓冲液，3种非标记核苷酸(dATP、dGTP、dTTP)各20mol,BSA 0.4g/L,Klenow酶5 IU，-32PdCTP 50Ci，于室温标记过夜。Sephardex G-50柱层析法纯化标记探针，测定探针比放射活性大于1×108cpm/g DNA。4.3

13、RNA-DNA杂交：用一张膜先后与Cx探针和GAPDH探针杂交，即与Cx探针杂交、曝光、显影后，用煮沸的0.1% SDS摇洗尼龙膜至室温，重复2次，使Cx探针洗脱，再与GAPDH探针杂交。具体杂交过程如下：尼龙膜在双蒸水中浸湿后，6×SSC浸泡10min，然后在预杂交液(50%甲酰胺，5×SSPE，5×Denhardt,0.1%SDS，100mg/L ssDNA)中42预杂交4h，弃预杂交液，换同样液体加探针，42，杂交过夜(1624h)。用2×SSC,0.1%SDS于37洗膜2次，每次20min，然后用0.1×SSC,0.1%SDS于65洗膜

14、3次，每次20min。再将膜与X线片一同放入暗匣内，-70曝光315d，取出X线片，显影、定影。结果采用细胞连接蛋白基因Cx26、Cx31、Cx31.1、Cx32、Cx37、Cx40、Cx43和Cx46作为分子探针，通过Northern印迹法，发现不同发育阶段的胚胎不同器官的Cx基因表达呈不同状态(见Cx基因表达片)。不同胚胎器官Cx基因家族中Cx31、Cx31.1、Cx46不表达；而其他Cx基因则呈不同表达状态。1、3所示胎肝Cx26、Cx43在3个月胎龄时高度表达、2可见Cx32从第5周至5个月都呈高度表达。4为胃中Cx37的表达状态。肺中Cx40在35月呈高度表达；胎肾中Cx43的表达状

15、态从35月逐渐增强。Cx26、Cx32、Cx43，在肝、胃、肾等器官中不同程度表达；呈现出表达差异，结果见表2。表2不同胎龄不同器官的Cx基因表达Table 2 Expression of Cx genes in different organs at different fetal ages连接蛋白基因3个月3 month4个月4 month5个月5 monthCxgenes肝liver胃stomach肺lung肾kidney肝liver胃stomach肺lung肾kidney肝liver胃stomach肺lung肾kidneyCx26+-+-+Cx31-Cx31.1-Cx32+Cx37-+

16、-+-+-Cx40-+-+-+Cx43+-+-+Cx46-     +：高度表达，+：中度表达，+：低度表达，-：不表达或微弱表达+：high expression,+:middle expression,+:lower expression,-:no or weak expression 从以上Cx基因的表达状态可以看出：(1)在胚胎不同发育阶段及不同器官中连接蛋白基因呈不同的表达状态。(2)连接蛋白基因表达有器官多样性，如肝Cx32、胃Cx37、肺Cx40和肾Cx43基因表达。(3)连接蛋白基因在各种组织中的表达又有交叉性，如Cx26上述不同器官中呈

17、现出不同表达状态。(4)胚胎期肝、胃、肺、肾等器官中Cx31、Cx46、Cx31.1不表达。讨论连接蛋白基因表达呈器官多样性，表明不同器官的组织细胞间缝隙连接方式不同。形态学研究证实，不同细胞间缝隙连接通道类型、大小及通讯方式各不相同4。我们认为Cx基因表达的多样性可能与转录和翻译出不同的细胞连接蛋白，装配成不同的缝隙连接通道有关。连接蛋白基因在各器官中的表达呈交叉性，如Cx26、Cx32不仅在肝脏表达，也存在于肾、肺、胃中，此现象与Willecke7的研究结果完全一致。说明不同器官的同类组织细胞间装配有相同的通讯通道。故Cx基因表达呈现交叉性。王绳琦8认为在胚胎发育早期缝隙连接出现，使在生长

18、控制、形态建立和细胞分化中起调节作用的物质通过细胞间转运成为可能。神经胚期脊索与外胚层之间的缝隙连接使脊索诱导外胚层发育形成神经管成为可能。Cx32在第5周至5个月胚胎肝中呈高度表达，与曾弥白9观察的结果一致，他认为，各器官原基范围内的细胞各自获得进一步分化的能力是和缝隙连接在同种细胞间的大量出现分不开的。本实验支持此观点。肝脏由内胚层形成肝憩室，其内胚层细胞向肝细胞分化离不开细胞间化学信息的交换。Cx32基因高度表达与肝细胞分化、增殖基本一致。Eghbali10将Cx32全长的cDNA转染到通讯缺陷的肝癌细胞内，Cx32 mRNA表达水平明显升高，膜上缝隙连接数目明显增加。同时发现Cx32转

19、染后的癌细胞生长迅速下降，细胞器结构恢复正常。证实Cx32基因表达能直接促进细胞分化。Cx40在胚胎肺高度表达，可能与呼吸系统原基的内胚层细胞分化为呼吸上皮有关。Cx43在胚胎肾3个月时表达，可能与肾单位的发生有关；因人肾经历了前肾、中肾及后肾发生过程；直到胚胎第3个月后肾内才开始有真正的肾单位形成，随该基因表达不断增强肾单位不断发育。Cx43在胚胎肝第520周呈不同表达状态，可能与胚胎肝脏的造血功能有关。因Cx43在健康肝脏中不表达，仅存于肝细胞癌中11。胚胎早期造血细胞从卵黄囊迁入肝脏，此时Cx43表达微弱，随后即迅速增强。至胚胎第3个月时造血组织占肝脏重量的30%35%此时Cx43表达达

20、到高峰。随着脾、胸腺、骨髓腔的形成，肝内造血细胞大多迁入上述器官，5个月胚胎肝内Cx43基因表达明显降低，动态地反映了肝脏造血功能减弱状态。Cx基因转染再表达研究表明Cx基因表达与细胞分化密切相关2。我们的研究表明：该基因的表达状态与胚胎细胞分化基本一致，故认为胚胎发育过程中，Cx基因表达对胚胎细胞分化具有重要作用。         1胚胎肝Cx26第5周呈微弱表达，第7周与第5个月低度表达，第3个月时高度表达、第4个月时呈中度表达2胚胎肝Cx32从第5周20周(5个月)都呈高度表达3胚胎肝Cx43第5和7周表达微

21、弱，第3个月胎龄时高度表达，第4月和第5月时表达明显降低4胚胎胃Cx37从第35个月都呈高度表达状态Fig.1 Cx26 gene in the liver of fetal is weak expression at the 5th week,lower expression at the 7th week and 5th month,high expression at the 3rd month (11th and 12th week),middle expression at the 4th month (14th and 16th week).Fig.2 Cx32 gene in t

22、he liver of fetal shows high expression from the 5th week to 5th month.Fig.3 Cx43 gene expression in the liver of fetal is weak from the 5th to 7th week,high expression at the 3rd month,and middle expression during the 4th to 5th month.Fig.4 Cx37 gene in the liver of fetal shows high expression from

23、 the 3rd month to 5th month. Cancer Research Institute,Hunan Medical University,Changsha 410078,China作者单位:张建湘?张小慧(湖南医科大学组织学胚胎学教研室，长沙410078)李桂源(湖南医科大学肿瘤所) 参考文献1Beyer EC,Paul DL,Goodenough DA.Connexin family of gap junction proteins.J Membr Biol,1990,116:(2),1872张志谦，林仲翔.连接蛋白家族、细胞间隙连接通讯与肿瘤抑制.生理科学进展，1994，25(2)：1213林仲翔.间歇连接通讯-生长调控-癌变三者之间的关系.细胞生物学杂志，1988，10(3)：1114成令忠主编.组织学.第2版，北京：人民卫生出版社，1994：1881925Warner AW,Guthrie,