新型无创DNA产前检测

1、新型无创DNA产前检测科学原理1997年，Lo等人(Lo Y. M. et al. 1997. Lancet )通过用 PCR法扩增母体外周血浆中Y染色体特异的 DNA片段，证明在怀有男性胎儿的母血浆中存在胎儿游离DNA (cell-free fetalDNA，cffDNA )。更进一步的研究发现，正常怀孕过程中cffDNA几乎全部来源于胎盘的滋养层细胞，孕妇外周血中的cffDNA从怀孕4周左右就可以检出，孕7周建立胎儿胎盘循环后cffDNA可以以一定的比例稳定存在于母体外周血浆中。cffDNA在外周血浆中是以 75bp-250bp的小片段形式存在的，有文献指出，绝大部分的cffDNA都是包裹

2、在核小体外部，与cffRNA相比，其在外周血浆中的性质更加稳定。血浆游离DNA含量很低，一般来说 1ml血浆中会有10ng左右的游离DNA，cffDNA占血浆中 全部游离DNA的5-30%之间，比例随着孕周的增大而缓慢上升。cffDNA的半衰期很短，为16.3分钟，在正常分娩后2小时后在母体外周血中已检测不 到(Lo et al. 1998. Am J Hum Genet )。有大量的报道显示，胎儿细胞可以在母体中存在数 年的时间。cffDNA快速降解的这种特性使其可以作为无创产前检测的最优检测材料。胎儿游离DNA特点含低片祈化胎儿漩离DNA片斷被舜 擁*大小从75bp-250bp 不罄，罟均

3、U>Jl66bp.半衰朋短毎臺升血浆中游离DNA为 納克(109g)级*菽中 胎儿游浆游分效后母体静脉血中的 胎儿常离DNA在窿小时 九占快速降解消失.缰I叭需妾总离扇敏廉、超离准确度的右法用于胎儿游親DNA的检测，以获絹精确定最结果2010年，Lo等人又在 Scienee Translational Medicine杂志发表文章， 第一次证明母血外 周血浆存在胎儿的全基因组cffDNA序列，使得从理论上可以利用母体外周血浆进行针对胎儿的几乎全部染色体非整倍体的无创产前检测。以出生缺陷中最常见的染色体非整倍体病唐氏综合征为例，来说明无创染色体非整倍体产前检测的科学原理。正常胎儿和正常母亲

4、的21号染色体均为2倍体，患有唐氏综合征的胎儿其21号染色体为3倍体。我们假定母亲外周血中cffDNA的含量为20%，母体自身游离DNA占80%，为了简便表示，假定共有10份DNA拷贝。对于怀有正常胎儿的孕妇来说， 其外周血浆的21号染色体游离 DNA就是10份，2份来源于胎儿，8份来源于母亲。对于 怀有唐氏综合征胎儿的孕妇来说，可以很容易算出其外周血浆的21号染色体游离DNA有11份，3份来源于胎儿，8份来源于母亲。对于cffDNA的含量为20%的情况而言，怀有唐氏综合征胎儿和正常胎儿的母体外周血 浆21号染色体游离 DNA比例就是11: 10。同样，对于cffDNA的含量为5%的情况而言，

5、 怀有唐氏综合征胎儿和正常胎儿的母体外周血浆21号染色体游离DNA比例就是10.25 :10。可以看到，不需要进行胎儿来源和母体来源游离DNA的分离，怀有唐氏综合征胎儿的孕妇外周血浆21号染色体游离DNA的总含量有个很小比例的升高，为了区分这种细小的差别，要求我们建立一个灵敏度极高的分子检测技术平台。技术依据随着第二代测序技术的发展，目前每张测序芯片可以轻易的同时测定超过15亿条DNA序列，产出300G的原始数据，相当于 1个人类基因组的100倍。当我们用新一代测序技术 来分析母体外周血浆中的游离DNA信息的时候，无创染色体非整倍体产前检测便可以从理论变成现实。在实际操作中，我们通过第二代测序

6、技术平台每个样本测定1000万条血浆游离DNA序列，然后将这1000万条序列通过生物信息比对的方法定位到标准的人类基因组参考图谱 上，每条序列都有唯一的一个对应位置，这个位置包含了染色体、基因、核酸起始点等多种综合信息。对于每条序列我们只需要提取出来相对应的染色体信息，计算出来在这个样本中测定的1000万条序列被分配到每条染色体的具体比例数值。在每个样本测定1000万条序列的基础上，其每条染色体的比例数值都在一个非常固定 的范围，一般来说 CV不会超过1%,超过上述所需的分辨率。因此我们只要观察测定出来 的21号染色体比例数值是否偏离标准量既可以推断出胎儿是否是染色体非整倍体患儿。为 了获得足

7、够大的统计效力，一般设定为3倍的标准差作为阳性的 cutoff，通过用Z检验来计算测定出的染色体比例数值的偏移量，也就是说Z的cutoff为3, Z大于3就意味着在统计上有99.9%的power可以确定为阳性样本。临床试验一期临床试验：2010年，公司与湖南湘雅医院产前诊断中心合作，开展针对无创DNA产前检测技术的一期临床试验一一大规模基于新一代测序技术的新型无创DNA产前检测临床研究。一期临床试验严格按照国际标准，采用回顾性实验设计，检测样本均由湖南湘雅医院产前诊断中心收集，且全部样本均有胎儿羊水或脐血核型检测结果作为对照，样本数共计412例。检测人员利用高通量测序技术对上述412例临床样本

8、中的血浆游离DNA进行高覆盖度测序，从而对胎儿的遗传状态做出判断。一期临床试验结果显示，该技术对五大染色体疾病（21三体综合征、18三体综合征、13三体综合征和X、Y性染色体非整倍体疾病）的复合检测灵敏度为100%，复合检测特异性为99.7%以上（详见下图）。临珠试检结集闻旺怜：0/373 = 0假 IR性：C/14-0%连；易桧出一昭含型和一胡星楼型47,X<*2i（3Gy46= 4.77色丼檜剰结黑悄胡ft45X-0% (0/5)0.?5%(V407)XXX:0%. (0/1)0% (0411)XXV0% (0/1)0鳴0411)XW0% (0H)0% 0411)廉胡任0/4 - 0

9、悵阳检 1/408 = 0 J5%注：门3恃旺件力一*4*粹本表1 :一期临床试验结果统计灵敏度特异性阳性预测值阴性预测值Trisomy 21100% (40/40)100% (372/372)100% (40/40)100% (372/372)Trisomy 18100% (14/14)100% (398/398)100% (14/14)100% (398/398)Trisomy 13100% (4/4)99.75% (407/408)80% (4/5)*100% (407/407)二期临床试验：2011年初，针对无创 DNA产前检测项目，公司又与北京协和医院展开二期临床试验 研究，整合双方

10、的技术平台优势，开展具有前瞻性的高特异性、高灵敏度、高准确性的无创DNA产前检测工作。该试验已经于2012年5月18号顺利完成，并取得圆满成功。该试验是国际上首个大规模、前瞻性的针对胎儿染色体非整倍体疾病的无创DNA产前检测临床试验。试验严格按照国际标准设计与执行，利用贝瑞和康自主研发的无创DNA产前检测平台，对来自于北京协和医院和北京市海淀区妇幼保健院的2236例门诊 随机样本进行母体外周血中游离 DNA的深度测序，并结合生物信息学分析的方法，对游离 DNA中包 含的胎儿片段信息进行定量分析并对其遗传状态做出判断。经过双方接近1年的共同努力，通过严格的临床随访，本次临床试验的结果显示，无 创

11、DNA产前检测技术对于孕 12周以上胎儿的三大染色体非整倍体疾病（唐氏综合征、爱 德华氏综合征、帕陶氏综合征）的准确率接近100%，假阳性率为0.05%。该结论与2011年由湘雅医院产前诊断中心和贝瑞和康共同完成的回顾性临床试验结果几乎完全一致。阶段性研究成果已由北京协和医院于2012年4月28日在沈阳召开的 一2012盛京母胎医学论坛 上公布，其结果获得了行业内各方专家的关注与好评。技术优势1. 无创伤性只需抽取10ml母体静脉血即可检测；无感染、无流产风险；极大的缓解了孕妇及家属的心理负担。2. 灵敏度/特异性高目前针对21三体综合征（T21 ）、18三体综合征（T18 ）、13三体综合征

12、（T13）进行检 测。三大染色体的非整倍体疾病的检测灵敏度/特异性均可达到 99%以上。3. 孕早期检测孕12周以上即可检测。4. 检测周期短采血后，10个工作日内出具检测报告。5. 自动化操作，易于质量控制完全在DNA分子水平上进行操作，测序过程和数据判读完全自动化，降低人为干预，数据均一性高，适合大样本量集中检测。6. DNA水平检测，可检测多种染色体疾病目前我们可准确检测 21三体综合征（T21 ）、18三体综合征（T18 ）、13三体综合征（T13 ）。同时正在进行以下染色体疾病检测的临床研究：染色体结构异常疾病（微插入、微缺失）遗传性疾病（地中海贫血、白化病、先天性耳聋等）流程与质控

13、检测流程： 无创DNA产前检测技术仅需抽取孕妇的静脉血，便可用于胎儿染色体疾病的检测，具体检测流程如下:产 nwiMasn*« n流程中的质量控制（QC）:为了确保检测结果的准确性，我们在整个检测流程中建立了严格的质量控制体系。从最初的 血液样本采集，到最终的检测报告生成，全程式、多方位的质量控制体系确保了检测结果的 准确：样本制爸环节 QC抽m皿桨分矯血浆转运文库制备环节生化反应产物纯化 1QCA上机测序环节上机测序多宙混合生物信息分析环节» QC住列比对丄A染昭计数dQC尹生成报告相关文献I Chiu RWK, et al. Nonin vasive pren atal

14、 diag no sis of fetal chromosomal an euploidy by massively parallel genomic seque ncing of DNA in maternal plasma.Proc Natl Acad Sci USA,2008,105: 20458-20463.背景：胎儿染色体非整倍体疾病的客观存在是孕妇决定进行产前检测的主要原因。目前，可用于胎儿染色体疾病确诊的方法主要依赖于侵入性的产前诊断，如绒毛膜取样、羊水穿刺， 但是上述方法都具有一定的流产风险。胎儿DNA在母体血浆中被发现，不过与高背景的母体DNA相比，胎儿DNA在母体血浆中的含

15、量是很低的，因而由于胎儿的染色体非整倍体 而导致的母体血浆染色体剂量的变动是很微量的。为了达到必要的分析精度，即使使用高准确率的单分子计数方法，如数字PCR,也会为了获得足够量的DNA分子而采集大量的母体血浆，作为一项检测而言，这显然是不现实的。目的：借助高通量测序的方法，定量研究胎儿21号染色体三体所带来的母体血浆DNA的变动，非侵入性地诊断T21胎儿。方法：采用高通量测序的方法，对28例母体血液样本进行检测。全部样本均有胎儿核型分析结果作为对照。结果：28例母体血液样本用于该项检测，其中14例T21胎儿和14例正常胎儿全部被正确检出。结论：作为一项新型的非侵入性产前诊断方法，高通量测序可用

16、于判断胎儿的染色体非整倍体疾病检测，将来还可广泛的应用于所有孕妇的产前检测。l Fan HC, et al. Nonin vasive diag no sis of fetal an euploidy byshotgu nseque ncing DNA from maternal blood.Proc Natl Acad Sci USA,2008,105: 16266-16271.目的：研究高通量测序的方法是否可用于胎儿染色体非整倍体的产前检测。方法：使用高通量测序的方法直接对母体血浆中的游离DNA进行测序，每个测序样本平均获得了 5百万条的序列标签信息。 通过这些序列标签信息， 可以对胎儿染

17、色体数目异常所造 成的染色体过高、过低表达进行分析，从而判断胎儿是否存在染色体非整倍体疾病。结果：在本文的研究中，通过测序的方法从18例包含染色体正常和异常胎儿的样本中，成功检出了全部的 9例T21胎儿、2例T18胎儿和1例T13胎儿。同时发现对于胎儿染色体 的检测可以最早在孕14周进行。研究人员使用测序的方法又进一步研究了血浆游离DNA的特性，发现血浆中的游离DNA是以核小体的形式存在的。结论：由于测序技术是非多态性依赖的，因而它可以广泛的应用于胎儿染色体非整倍体疾病的非侵入性产前检测。l Glenn E. Palomaki, et al. DNA sequencing of materna

18、l plasmatodetect Down syndrome: Aninternational clinical validation study.Genet Med,2011.目的：虽然用于T21的产前筛查技术在不断的改进，但侵入性的产前诊断过程所带来的风险依然存在。测定母血中的游离DNA为避免上述问题提供了一种可能。方法：本文采用双盲的实验设计，对来源于4,664位T21高危孕妇的血样样本进行研究。采用新一代DNA测序的方法，对上述样本中预先选出的1,696例样本(包含212例T21阳性样本和1,484例T21阴性样本)进行检测分析，上述检测样本均有核型分析结果作为对照。整个检测过程参照美

19、国 CLIA标准进行。结果：新一代DNA测序技术对于T21检测灵敏度98.0% (209/212)，假阳性率0.20% (3/1,471)，13例样本检测失败(0.8% )。结论：对于高危孕妇，新一代DNA测序的方法几乎可以检出全部的T21胎儿，而且仅有很低的假阳性率。该技术可以大大降低产前检测对于侵入性产前诊断技术的依赖，进而降低胎儿的流产率。虽然这项技术的大幅度推广还需要一段时间，但该实验结果对于该项技术提供临床数据上的支持。l Glenn E. Palomaki, et al.DNA sequencing of maternal plasma reliably identifies tr

20、isomy 18 and trisomy 13 as well as Down syndrome: an international collaborative study.Genet Med. 2012, doi: 10.1038/gim.2011.73.目的：研究母体血浆中的游离DNA是否可用于胎儿 T18和T13的检测。方法：采用新一代DNA测序的方法，从待检样品中检出62例T18 ,12例T13 （另检出212例T21，其结果已另行对外发表），全部待检样本均有核型对照结果。对于T18和T13的检测结果采用 CG调整的方法进行计算。结果：整个研究过程完成检测样本 1,971例（占全部可用

21、样本 1,988例的99.1%），对于T18 的检测灵敏度为 100%（ 59/59），假阳性率 0.28%; T13的检测灵敏度为 91.7%（ 11/12）， 假阳性率0.97%。结论：对于高危孕妇，运用测序的方法检测母血中的游离DNA,几乎可以全部检出 T21、T18、T13胎儿，并且仅有较低的假阳性率。这种非侵入性的产前检测方法可以有效地降低由于侵 入性产前诊断造成的 95%的胎儿流产事件。上述结论有临床实验数据支持。I Diana W. Bianchi, et al. Genome-Wide Fetal Aneuploidy Detection by Maternal Plasma

22、DNA Sequencing. Obstet Gynecol, 2012, 119. doi: 10.1097/A0G.0b013e31824fb482.目的：研究大规模并行测序的方法是否可用于胎儿染色体非整倍体的产前检测。方法：该研究的检测样本来源于美国60个产前诊断中心的2,882名孕妇。对这些待检样本采用生物统计的方法，从中选出一定比例的胎儿染色体核型正常和异常的单胎孕妇样本进行 双盲检测，上述检测样本均有染色体核型分析的对照结果。每个检测样本均采用大规模并行测序的方法进行测序，所得测序结果再与胎儿的染色体核型进行对比分析。结果：采用大规模并行测序的技术对532个样品进行检测，结果显示T

23、21的检测灵敏度为100%（ 89/89），T18 的检测灵敏度为 97.2%（ 35/36），T13 的检测灵敏度为 78.6%（ 11/14），同时对于女性胎儿的检测灵敏度为99.6%（ 232/233），男性胎儿的检测灵敏度为100%（184/184），另检出15例的45X，检测灵敏度为93.8%（ 15/16）。对于胎儿染色体非整倍 体疾病的检测结果没有出现假阳性，特异性100%。此外，我们还检出了3例T21的嵌合体（3/3）,1例T18的嵌合体（1/1），2例45X的嵌合体（2/7）,3例染色体三体异位型，以及 2例其他染色体数目异常 （20号和16号染色体）。其他的性染色体非整倍体

24、 （XXX、XXY、 XYY ）也被成功的检出。结论：这项研究表明，利用大规模并行测序的方法检测母血中的DNA，可用于胎儿染色体非整倍体疾病的检测。该技术对于T21、T18、T13和45X具有较高的检测灵敏度和特异性，可作为一种胎儿染色体非整倍体疾病的非侵入性检测手段，以减少侵入性产前诊断的风险。Lo YM, et al. Presence of fetal DAN in maternal plasma and serum.Lancet, 1997,350: 485-487.Lo YM, et al. Plasma place ntal RNA allelic ratio permits no

25、nin vasive pren atal chromosomalaneuploidy detection.Nat Med, 2007,13: 218-223.Fan HC, Quake SR. Detect ion of an euploidy with digital polymerase cha in react ion.Anal Chem, 2007,79: 7576-7579.Lo YM, et al. Digital PCR for molecular detect ion of fetal chromosomal an euploidy.Proc Natl Acad Sci USA

26、, 2007,104:13116-13121.Tianjiao Chu, et al. A novel approach toward the challe nge of accurately qua ntify ing fetal DNA in maternal plasma.Pre nat Diag n, 2010,30: 1226 229.Gary J.W. Liaoet al.Targeted Massively Parallel Seque ncing of Maternal Plasma DNA Permits Efficie nt and Un biased Detectio n

27、 of Fetal Alleles.Cli nical Chemistry, 2010,57:1.Lo YM, et al. Maternal Plasma DNA Seque ncing Reveals the Gen ome-Wide Gen etic and Mutational Profile of the Fetus. Sci Transl Med, 2010,2, 61ra91.Chiu RWK, et al. Maternal plasma DNA an alysis with massively parallel seque ncing by ligati on for noninvasive prenatal diagnosis of trisomy 21.Chin Chem, 2010,56:459-463.RossaWK Chiu,et al.N on-i nvasive pren atal assessme nt of trisomy 21 by multiplexed maternal plasma DNA seque ncing: large scale validity study.BMJ, 2011,342:c740