血管性痴呆动物模型的研究进展

1、血管性痴呆动物模型的研究进展            【关键词】  血管性痴呆    【摘要】  目的  将目前主要的血管性痴呆（VD）动物模型的制作方法和优缺点加以归纳整理，为VD的基础研究提供合理的动物造模方法。方法  将近年来有关VD动物模型方面的文献进行归纳整理。结果  为血管性痴呆新模型的研究建立基础。结论  虽然VD模型的制作方法很多，但是目前采用的公认合理的方法并不

2、多，因此建立一种脑缺血所致的VD动物模型对于深入探讨VD的发病机制、病理学特点以及对于临床患者的早期诊断、早期治疗甚至早期预防均有重要意义。【关键词】  血管性痴呆；动物模型    血管性痴呆(vascular dementia，VD)是由一系列脑血管因素导致脑组织损害引起的痴呆综合征，它是老年期痴呆的主要类型之一，并且随着人类社会的老龄化，VD已是国内外医学界研究的重要课题。在实验研究方面，无论中医、西医首要解决的问题是寻找适当的动物模型。但目前关于动物模型的制作方法只散见于各类期刊中，本文旨在总结出各类模型制作的方法和优缺点，为深入探讨VD的发病机制

3、、病理学特点以及对于临床患者的早期诊断、早期治疗甚至早期预防研究痴呆新的防治途径建立基础。目前流行的血管性痴呆的动物模型有以下2种。1  全脑缺血模型1.1  改良的Pulsinelli的4-血管阻断全脑缺血法(4VO)1  将实验大鼠用10%的水合氯醛(0.5ml/100g)腹腔麻醉后，背侧颈正中切口，暴露双侧第一颈椎横突翼小孔，用直径为0.5mm的电凝针插入双侧翼小孔烧灼双侧椎动脉，造成永久性闭塞。然后腹侧颈正中切口，分离双侧颈总动脉，穿结备用。24h后用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉5min，共夹闭3次，每次间隔1h。术后手术部位施以适量青霉素对抗感染，然后缝合，

4、常规饲养观察。优点是检验缺血是否成功的指标明确，无需再筛选，可进行再灌注损伤的研究，海马损伤明显，可显示记忆功能的减退；缺点是手术较复杂，动物死亡率高。这是由于双侧椎动脉的灼闭使脑干的血液供应受到了很大影响，使实验动物的生命中枢受到了抑制的结果。对于椎动脉的阻断一般采用电凝固的方法，但这种方法不仅易出血，且不能复通再灌，实验操作的熟练程度直接影响实验效果。1.2  双侧颈总动脉永久性结扎的脑缺血模型(2VO)2  仰卧位固定大鼠，颈正中切口，仔细分离肌肉，分出双侧颈总动脉并埋线，用丝线结扎双侧颈总动脉，缝合切口。优点是手术简单、创伤小、重复性好、死亡率低。国外学者认为2VO

5、法是研究人类痴呆的病理生理学和治疗药物的一个较好的模型3；缺点是其提供的是全脑不完全性缺血模型(慢性低注)，对脑以外的其他脏器也有影响，与人类脑梗死通常由单一脑动脉闭塞所致的情形不同，且无法进行健侧与患侧的自身对照研究。常规的2VO法造模使动物难以长期存活。王兴华等4研究发现，改进的2VO法(间隔1周，分2次结扎颈总动脉)，可大大降低动物的死亡率。但仅结扎双侧颈总动脉，由于大脑动脉环的代偿作用，侧支循环的建立，往往难以达到理想的脑缺血，从而影响模型的可靠性。1.3  双侧颈总动脉缺血再灌注5  大鼠用20%乌拉坦(kg/kg)腹腔注射麻醉，分离双侧颈总动脉并结扎，2次短时使

6、血流阻断，同时从尾尖部放血(不超过1ml/100g体重)，然后使血流复通。术后即行腹腔注射生理盐水10ml。优点是手术简单易操作、死亡率低、重复性好，模拟了人类短暂反复型脑缺血过程；缺点是由于大鼠侧支循环较强，不易做长期观察，缺血和再灌注时间的长短同实验结果有密切的关系。1.4  双侧颈总动脉结扎合并降血压法  此法通过降低实验动物的基础血压，从而加重动物的脑损伤程度。王蕊等6对两血管阻断法加以改进，将大鼠再夹闭双侧颈总动脉之前，腹腔注射硝普钠2.5mg/kg，随即用动脉夹反复夹闭再通2次，术后大鼠经行为学和病理学检查证明造模成功。值得注意的是，硝普钠注射量的准确、可靠以及

7、环境温度的恒定都很重要，否则会对血压造成影响，进而影响造模效果7。1.5  三血管阻断再开放(3VO)8  Kameyama等首先报道3条血管关闭模型。先分离两侧CCA备用，咬去枕骨腹侧面部分颅骨，暴露延髓腹侧面，直视下用5-0丝线结扎基底动脉，然后用动脉夹夹闭两侧CCA，形成3条动脉阻断全脑缺血模型。一定时间后，解除双侧CCA的夹闭，血流再通，形成再灌注。优点是缺血较为迅速，缺血效果好，再灌注血流恢复迅速，比较适用于急性全脑缺血性疾病损伤的研究；缺点是需开颅，暴露基底动脉，手术创伤大，在手术中对周围组织、神经牵拉较严重，尤其是在暴露及夹闭基底动脉时，易损延髓。1.6

8、60; 颈内动脉分流模型9  将颅顶皮肤剪开，在颅顶左右冠状缝后矢状缝旁开各约1mm处分别钻洞，安装不锈钢电极，与脑电图负极连接，将参比电极插在同侧耳后皮下。做颈部正中切口，分离左右颈总动脉，另做两侧股部切口，分离左侧股静脉和右侧股动脉。从股静脉注射肝素(625u/ml)0.3m1，并插入聚乙烯导管与自制的微型输液器连接，从右侧股动脉插入充满肝素的聚乙烯导管，与压力换能器连接；从右侧颈总动脉向远心端插入自制的聚乙烯导管，导管夹闭，导管下接贮液器。记录两侧脑电波、动脉血压，作为对照结扎左侧颈总动脉，同时从右侧颈总动脉导管放血，收集流出血液，并从右侧股静脉回输入体内缺血一定时间后，解除左

9、侧颈总动脉结扎，同时结扎右侧颈总动脉停止放血，将流出的血液全部输回体内后不再输液。缺血较3VO模型缓和，并且还可以通过控制放血速度来调整全脑缺血发生的速度，因而适用于亚急性、慢性全脑缺血性疾病损伤的研究。缺点是手术条件要求较高，技术较复杂。1.7  左心室注射液体石蜡模型10  鉴于以往的栓塞法需分离结扎颈总动脉，将异物导入脑内，手术方法复杂，解放军总医院老年医学研究所张京立等学者创立的左心注射液体石蜡，建立多发性脑梗死动物模型的方法1。认为液状石蜡入脑途径与临床病理变化相似，且这种方法避免了颈部手术，便于护理和多指标观察。2  局灶性脑缺血模型2.1 

10、 光化学诱导血栓形成方法12  Watson首次建立了光化学诱导脑皮质梗死动物模型。立体定向仪固定大鼠头部，暴露颅骨，尾静脉注射光敏材料荧光素、荧光素钠、四碘荧光素二钠或四碘四氯荧光素二钠，然后用特定冷光源(卤素灯或氙灯)照射局部头颅，光线透过头皮切口处的颅骨与血管内的染料接触，激发光化学反应，产生单线态氧，引起皮层内血管内皮细胞损伤，血小板聚集，导致照射区内血栓形成，皮层缺血坏死，血栓形成，皮层缺血坏死。一般认为缺血只波及背外侧纹状体，而海马、丘脑和其他底节区等皮层下结构不受累。优点是该模型梗死部位明确，原理清楚，操作简单，损伤性较小，重复性好，学习记忆障碍明显，动物存活时间长，而

11、且病理改变和超微结构变化与人类血管性痴呆相似；缺点是由于微血管损害和血-脑屏障开放早，与人类常见的缺血性脑卒中存在差异，且光敏物质的导入对研究全身血液循环系统的变化，掺入了复杂因素13。2.2  颈内动脉注射微小栓子模型14  参考Kaneko等的方法加以改进，用生理盐水0.3ml加入同种大鼠血凝块1mg制成混悬液，显微镜下测量直径为40200m，然后从实验大鼠双侧颈总动脉推注栓子盐水混悬液，在注入栓子的同时开放颈总动脉，利用颈总动脉的血流将栓子通过颈内动脉送入颅内至鼠脑各动脉，造成多灶性脑梗死。优点是不需开颅，操作简单，与临床梗死性脑卒中病理过程最为贴切，缺血效果可靠；缺

12、点是由于栓子的随机性，无法预测梗死的部位和大小，侧支循环的影响使组织缺血程度不一，不利于神经症状观察和组织定量分析13。2.3  插线法15，16  目前该模型具有代表性的方法是Koizumi和Longa法。Koizumi于1986年首次报道不用开颅的大鼠大脑中动脉（MCA）可逆性阻断模型的制备方法。分离一侧颈总动脉（CCA）以阻断颅外来源的侧支循环。由颈外动脉（ECA）残端插入一顶端粘有硅橡胶的尼龙单丝线，沿ECA、CCA分叉部和颈内动脉（ICA）轻柔推进，至ICA颅内分叉部时可阻断流入MCA的血流。Zea-Longa(1989年)以顶端烫成光滑圆球的4-0尼龙单丝线，由

13、CCA分叉处切口导入，也制成相似的模型。这种模型缺血部位恒定，且可进行再灌注，模拟了人类永久性及短暂性局灶性脑缺血的不同状态16。优点是无需开颅，MCA闭塞效果较理想，是目前能进行再灌注损伤研究的较理想局部脑缺血模型；缺点是结扎枕、甲状腺上、咽升、舌、上颌外和翼腭动脉需要一定手术技巧，动物体重要求严格，模型实质是栓塞性脑卒中，与人群常见的脑卒中存在差异。2.4  大脑中动脉凝闭(MCAO)  选用长2.5cm，直径0.205mm的尼龙丝，从大鼠颈外动脉分支处插入，同时将颈外动脉残断牵向外下方，使之与颈内动脉成平行走向，拉直与颈内动脉的夹角，将尼龙丝顺颈内动脉走向轻轻推进，直

14、至尼龙丝在动脉外尚余12mm长。此时插入的尼龙丝正好封闭人脑中动脉开口，阻断人脑中动脉血流，从而制成VD模型17。优点是开颅法闭塞MCA，实验条件较恒定，缺血效果可靠，是迄今应用最广泛的经典性局灶脑缺血模型；其缺点是：(1)对毗邻脑组织可能产生损伤；(2)潜在的脑脊液瘘形成；(3)对于血管的过多操作及继发血管痉挛可影响缺血后的侧支循环；(4)损害咀嚼功能，术后影响动物进食。2.5  内皮素法  这个方法的应用于1993年首次被报道18，其应用原理是通过立体定位仪注入内皮素，利用其血管收缩作用，可逆性阻断MCA的血流。优点是对动物损伤很小，手法简单，但其所致梗死可能与其他方法

15、所致梗死有所不同，药物筛选的实验结果也会有差异，且需要开颅，国内用此法较少。2.6  舌下静脉注入铁粉法  将已达迷宫训练标准的实验大鼠，给予2.5%硫喷妥钠麻醉后用Fe3O4粉(铁粒子直径为6mm，用量56.4mg/kg)溶于1.5ml生理盐水中，于1min内沿大鼠舌下静脉注入，从而造成VD大鼠模型19。优点是操作简单，可重复性强，安全可靠，术中不必开颅，适于慢性实验；缺点是缺血部位较局限且本模型仅模拟了单一部位(额部)的缺血梗死，至于脑的其他区域梗死和痴呆症的关系如何？梗死范围除局限于小磁铁放置部位下面相应脑组织以外，其余部位不知是否累及。3  展望随着血管性

16、痴呆研究的深入，血管性痴呆动物模型的制作也较以前有所发展和完善。但每种方法仍或多或少地有不尽如人意之处，因此扬弃各方法的缺点，寻找最佳模型制作方法：血管内栓塞法中的血凝块栓塞法栓子为同种异体或自体血凝块，与临床脑梗死的情况一致，但需从颈外动脉逆行插管，手术方法复杂。而石蜡法手术方法简单，仅需从左心室注入，但栓子是液状石蜡，与临床不符。如能用血凝块从左心室注入，则去二者之缺点，取二者之优点，不失为一好方法；4VO、2VO及栓塞法虽被普遍认同，但他们共同的缺点是梗死灶广泛且不固定；而光化学法制作的模型梗死灶固定，重复性好，可引用于VD的模型制作。如能配合脑组织定位照射，效果一定更好。目前VD的确切

17、发病机制尚未完全清楚，VD导致的学习记忆功能丧失是一个极其复杂的病理生理过程，脑血管病和痴呆的关系仍是未解之谜。模拟人类缺血性脑血管病的发病过程，建立重复性好、生理指标控制严格、利于病理指标观察的标准化活体缺血性动物模型，一直是研究者们所追求的目标，因此，分析VD动物模型，对了解脑是如何完成学习记忆可提供有益的信息，并且可以为评估学习记忆障碍的治疗提供一个有效的工具。相信随着科学技术水平及实验手段的不断提高，理想的VD动物模型将会问世。（致谢：本文感谢陈华德老师的指导！）【参考文献】3  Nanri M，Watanabe H. Availability of 2VO rats as

18、a model for chronic cerebrovas cular disease.Nippon Yakurigaku Zasshi，1999，113(2)：85-95.6  王蕊，杨秦飞，唐一鹏，等.大鼠拟“血管性痴呆”模型的改进.中国病理生理杂志，2000，16(10)：914-916.8  Kameyama M. A new model of bilateral hemispheric ischemia in the rat three vessel occusion model.Stoke，1985，16：489.12  向敬，匡培根，张凤英，等.颞叶梗塞所致学习记忆障碍的机制研究(微透析分析和超