双水相萃取牛血清蛋白

1、word双水相萃取牛血清蛋白一.实验目的1.了解双水相系统的成相原理和方法；2.了解制作双水相系统相图的方法，加深对相图的认识；3.掌握双水相溶液配制与双水相萃取的操作；4.掌握分配系数和萃取收率的计算方法。二. 实验原理双水相系统是由两种互不相溶的聚合物如聚乙二醇PEG与葡聚糖DX或者互不相溶的聚合物溶液和盐溶液如PEG与NH42SO4组成。双水相系统的制备一般是将两种溶质分别配制成一定浓度的水溶液，然后将两种溶液按照不同的比例混合，静止一段时间，当两种溶质的浓度超过某一浓度范围时，就会产生两相。相图是研究双水相萃取的根底，双水相形成条件和定量关系常用相图来表示。图1是典型的高聚物-高聚物双

2、水相体系的直角坐标相图，两种聚合物A、B以适当比例溶于水就会分别形成有不同组成的两相，上相组成用T点表示，下相组成用B点表示，由图1可知上下相所含高聚物有所偏重，上相主要含B，下相主要含A。曲线TCB称为结线，直线TMB称为系线。结线上方是两相区，下方为单相区，假设配比取在曲线上，那么混合后，溶液恰好从澄清变为混浊。组成在系线上的点，分为两相后，其上下相组成分别为T和B，T、B量的多少服从相图的杠杆定律。即T和B相质量之比等于系线上MB与MT的线段长度之比。又由于两相密度相差很小，故上下相体积之比也近似等于系线上MB与MT线段长度之比。图1 A-B双水相体系相图双水相萃取与有机溶剂萃取原理相似

3、,都是依据物质在两相间的选择性分配原那么。当物质进入双水相体系后，由于外表性质、电荷作用和各种力如憎水性、氢键、离子键等的存在，使得待别离的物质在上、下相中的浓度不同。对于某一物质，只要选择适宜的双水相体系，控制一定的条件就可以得到适宜的分配系数，从而到达别离纯化的目的。本实验选择PEG-硫酸铵双水相系统萃取牛血清蛋白。双缩脲反响是指蛋白质在碱性溶液中与二价铜离子结合生成紫色络合物的反响。含有两个或两个以上肽键的化合物都具有双缩脲反响，蛋白质含有多个肽键，因此有双缩脲反响，反响生成物颜色的深浅与蛋白质含量成正比，因此可以利用双缩脲反响进行蛋白质的定量测定。三、试剂及仪器仪器：紫外可见分光光度计

4、，电子天平，台式高速离心机，电热恒温水浴箱，漩涡混合仪，滴定管，大试管，离心试管(20mL)6只，移液管(1mL,5mL)，试管10mL，注射器10mL试剂：PEG2000，硫酸铵，牛血清蛋白，双缩脲试剂四、实验内容1、PEG2000-硫酸铵双水相体系相图的测定1取50%的PEG2000溶液w/v10mL于大试管中；2用40%的硫酸铵溶液w/v装入滴定管中向大试管滴加，并不断在漩涡混合器上混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内液体出现浑浊为止，记录硫酸铵消耗的体积。参加1mL水使溶液澄清，继续用硫酸铵滴定至恰好混浊，重复7次，记录每次硫酸铵消耗的体积，计算每次出现混浊时体系中PEG和硫酸铵的浓度

5、w/v,并填入表1中。3以硫酸铵的浓度w/v为横坐标，PEG的浓度w/v为纵坐标作图，即得到PEG2000-硫酸铵的相图。2、利用PEG2000-硫酸铵双水相体系别离牛血清蛋白1利用双水相体系别离牛血清蛋白根据相图，选择三个成相比例，分别参加3mL浓度为10mg/mL牛血清蛋白溶液。搅拌均匀，3500r/min离心5min，静置分层，分别量取记录上下相的体积。2蛋白质浓度的测定标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清蛋白BSA配制成10mg/mL 的标准蛋白溶液。标准曲线的测定：取七支试管分别参加0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5,0.6mL的标准蛋白质溶液，并用水补足到1mL,然后参加4m

6、L双缩脲试剂A NaOH 3.5mL, B CuSO4 0.5 mL，充分摇匀后在室温下放置30min，在540nm波长下测定吸光度。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照样。以蛋白质含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。样品的测定：按照标准曲线测定方法，分别取上下相溶液1mL置于两支试管中，分别参加4mL双缩脲试剂测定吸光度。与标准曲线对照，计算出牛血清蛋白的含量和萃取收率。五：实验数据记录与处理1、 原始数据图片2、PEG2000-硫酸铵相图制作以及成相比例选择表一：PEG2000-硫酸铵相图制作表V初PEG(ml)V水(ml)V硫酸铵(ml)V总(ml)M硫酸铵(ml)CpegC硫

7、酸铵1002.4212.420.96840.26%7.79%1012.9813.981.19235.77%8.53%1023.8615.861.54431.53%9.74%1034.9617.961.98427.84%11.05%1046.0520.052.42024.94%12.07%1057.1622.162.86422.56%12.92%1068.3424.343.33620.54%13.71%1079.5426.543.81618.84%14.38%表二：PEG2000-硫酸铵成相比例选择CpegCs24.94%12.50%24.94%13.00%24.94%13.20%图1：PEG2

8、000-硫酸铵相图及成相比例选择2、 BSA标准曲线的制作表三：BSA标准吸光度曲线CBSAmg/mlA5400010.06920.12930.17440.22650.27460.328图2：BSA标准吸光度曲线4、 BSA在双相中的分布表四：BSA在双相中的分布及K，R，P的计算Cpegm/vC硫酸铵m/vVt(ml)Vb(ml)ABStABSbCtm/vCbm/v24.94%12.50%11.306.700.0440.2600.6064.65924.94%13.00%10.907.100.0340.2320.4184.13324.94%13.20%10.507.500.0370.2200.

9、4753.908Cpegm/vC硫酸铵m/vMtmgMbmgM总mgKRP24.94%12.50%6.84831.21238.0600.1301.68782.01%24.94%13.00%4.56029.34633.9060.1011.53586.55%24.94%13.20%4.98429.31134.2950.1211.40085.47% 六：讨论本次试验总体进行较为顺利，标曲线性拟合度很高，根据相图选择的成相比例也成功成相，并且由表四可以看出，选择的三个成相比例均表现良好的收率均为80%以上。但在计算上下相总蛋白质量时，发现总蛋白质量高于参加量，猜想原因如下：1、 同一相中蛋白浓度分布不均：离心导致上下相中的蛋白分布不均，表现在同一相中，偏下层蛋白浓度要高于上层，由于取样时下相偏好取底部样品，上相偏好取顶部样品，且蛋白质多分布于下相，导致出现误差。2、 操作问题:由于未做重复且样数太少，不排除操作过程中受外来杂蛋白的影响或吸光度测定时的操