生物信息学_primer

1、PRIMER PRIMER 5.0 引物和探针的区别引物：引物：是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链。引物一般是指比较短的引物一般是指比较短的，用来进行，用来进行PCRPCR扩增的比较短的寡核苷酸。扩增的比较短的寡核苷酸。探针：探针：放射性同位素、生物素或荧光染料进行标记的已知序列的核酸片段，即为探针。探针是用来和探针是用来和PCRPCR产物杂产物杂交，上面标记有荧光，用来检测交，上面标记有荧光，用来检测PCRPCR产物数量的。产物数量的。常见错误说法 进行RT-PCR的探针管是由一对探针组成？是否还需要设

2、计引物？ 引物有2个，探针只有一个？ RT-PCR引物和PCR引物摸板都是DNA？是由加拿大Premier公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探针的设计和评估的软件，其主要界面同样也是分为序列编辑窗口（Genetank），引物设计窗口（Primer Design），酶切分析窗口（Restriction Sites）和Motif分析窗口。Primer简介FileFile菜单中的菜单中的ParameterParameter命令可以命令可以对系统参数，对系统参数，PCRPCR反应条件和程序反应条件和程序打分系统进行设置，以帮助用户打分系统进行设置，以帮助用户根据自己的特殊要求来进行引物根据自己

3、的特殊要求来进行引物设计，其中反应条件按照引物浓设计，其中反应条件按照引物浓度，单价离子浓度，度，单价离子浓度，MgMg离子浓度，离子浓度，NaNa盐浓度等。而打分系统是参照盐浓度等。而打分系统是参照的右框公式：的右框公式：根据一段氨基酸序列反推到根据一段氨基酸序列反推到DNA DNA 来设计引物，由于大多数氨基酸来设计引物，由于大多数氨基酸的遗传密码不只一种，因此，由的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推氨基酸序列反推DNA DNA 序列时，会序列时，会遇到部分碱基的不确定性。这样遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列

4、组成序列的混和物，它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。变化，称之为简并引物。 序列编辑（序列编辑（GenetankGenetank），引物设计），引物设计（Primer DesignPrimer Design），酶切分析），酶切分析（Restriction SitesRestriction Sites）和基序分析）和基序分析（MotifMotif） 引物设计实例分析PCR原理及步骤 PCR基本原理是在模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。加加热变热变性性退火退火引物

5、引物与靶与靶序列序列结结合合延伸延伸首首个个PCRPCR循循环环的的结结束束PCRPCR技术的特异性取决于引物与模板结合的特异性。技术的特异性取决于引物与模板结合的特异性。 确定目的基因序列确定目的基因序列确定目的基因序列确定目的基因序列确定目的基因序列基因特点描述基因特点描述最上面一层左面是最上面一层左面是5 5个控制按钮，个控制按钮，用于实现引物设计中的各种功能，用于实现引物设计中的各种功能，包括引物自动寻找，寻找结果查包括引物自动寻找，寻找结果查看和引物编辑看和引物编辑 显示模板和引物序显示模板和引物序列及二者间的配对列及二者间的配对情况的显示情况的显示 显示两个引物的显示两个引物的各种

6、参数，包括各种参数，包括给引物的打分，给引物的打分，引物以及产物的引物以及产物的起始位置、长度、起始位置、长度、TmTm值、值、GCGC、简、简并性并性 有关于引物的有关于引物的二聚体结构、二聚体结构、发卡结构、错发卡结构、错配情况和引物配情况和引物间二聚体结构间二聚体结构的预测的预测 显示的是对显示的是对PCRPCR扩增有影扩增有影响的结构的位响的结构的位置，结构细节置，结构细节和稳定能和稳定能 根据模板序列寻找引物的界面，在该界面中可以设定所要搜索的引物的类型，包括PCR引物，测序引物和杂交探针以及引物所在的链；另外也能设定搜索引物的范围，以及最终PCR产物的长度和引物的长度等。在结果窗口

7、中给出了程序给该对引在结果窗口中给出了程序给该对引物的打分（物的打分（ratingrating）和上下游引物）和上下游引物的起始位置和长度以及产物的长度。的起始位置和长度以及产物的长度。通过直接点击各对引物在相应引物通过直接点击各对引物在相应引物搜寻界面中相应的显示引物的各种搜寻界面中相应的显示引物的各种信息。包括其各种参数和各种可能信息。包括其各种参数和各种可能存在的不利结构。存在的不利结构。利用引物编辑窗口对程序自动利用引物编辑窗口对程序自动找到的或手工找到的引物序列找到的或手工找到的引物序列进行编辑，以便用户能在引物进行编辑，以便用户能在引物引入突变及加入特定的酶切位引入突变及加入特定的

8、酶切位点，并对修改后的序列的二聚点，并对修改后的序列的二聚体结构、发卡结构和错配进一体结构、发卡结构和错配进一步评估。步评估。 除了以上的直观地对引物除了以上的直观地对引物进行基本的设计和评估功进行基本的设计和评估功能外，该程序还提供了多能外，该程序还提供了多种数据报告，主要通过种数据报告，主要通过ReportReport菜单和菜单和GraphGraph菜单菜单中命令来实现。中命令来实现。 将参与多序列比对的蛋白质序列中的任一条导入primer premier5中，再将其翻译成核苷酸序列，有密码子简并性，其结果是有n多条彼此只相差数个核苷酸的序列群。 总之要保证上下游引物都落在该简并链的保守区

9、域内，结果会有数对，分数越高越好。利用primer premier5设计简并引物密码子简并性可用一条有简并性的核苷酸链来表示（其中RAG，YCT，MAC，KGT，SCG，W AT，H ACT，B CGT，VACG， DA/G /T,N=ACG/T）引物设计原则引物设计有3 条基本原则： (1)引物与模板的序列要紧密互补 (2)引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 (3)引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)引物设计应注意如下要点 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，不适于DNA 聚合酶进行反应。

10、另外太短易形成错配降低特异性。 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 TmTm值：值：引物所对应模板位置序列的Tm 值在72左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种方法，如按公式Tm4(G+C)2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。 引物设计应注意如下要点 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。 引物设计应注意如下要点 G G值：值：指DNA双链形成所需的自由能

11、，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3端G值较低（绝对值不超过9），而5端和中间G值相对较高的引物。引物的3端的G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 55端序列的修饰与标记：端序列的修饰与标记：可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等。通常应在5端限制酶位点外再加1-3个保护碱基。引物设计应注意如下要点 同源性或互补性：同源性或互补性：两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。 引物引物3 3端的末位碱基对端的末位碱基对DNA DNA 合成效率有较大的影响。合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱