第二章微生物多样性总结

1、.第二章第二章 微生物多样性微生物多样性Chapter 2 Microbial Diversity曹曹 慧慧 教授教授.生物多样性生物多样性(biodiversity)这个单词是一个新创造的组合这个单词是一个新创造的组合词，由生物词，由生物(bio)和多样性和多样性(diversity)组合而成。组合而成。biological diversity由托马斯由托马斯拉夫卓伊拉夫卓伊(Thomas Lovejoy)于于1980年提出，年提出，而而biodiversity则由昆虫学家威尔逊则由昆虫学家威尔逊(E. O. Wilson)于于1986年年在国家研究委员会在国家研究委员会(National

2、Research Council, NRC)举办的举办的首次美国生物多样性论坛报告中提出。首次美国生物多样性论坛报告中提出。微生物多样性（微生物多样性（Microbial Diversity）是一定区域范围）是一定区域范围内的所有微生物种类和它们的生态环境总和。内的所有微生物种类和它们的生态环境总和。1.1 微生物多样性概念微生物多样性概念.微生物生态系统多样性（微生物生态系统多样性（Microbial ecosystem diversity）Species diversity is an index that incorporates the number of species in an

3、area and also their relative abundance. It is generally a much more useful value than species richness.Genetic diversity is a level of biodiversity that refers to the total number of genetic characteristics in the genetic makeup of a species. It is distinguished from genetic variability, which descr

4、ibes the tendency of genetic characteristics to vary.Ecosystem diversity refers to the diversity of a place at the level of ecosystems. It is contrasted with biodiversity, which refers to variation in species rather than ecosystems.From Wikipedia, the free encyclopedia1.2 微生物多样性的三个层次微生物多样性的三个层次.1.3

5、微生物多样性表现形式微生物多样性表现形式v形态多样性（形态多样性（Morphological diversity）v代谢多样性（代谢多样性（Metabolic diversity）v生态多样性（生态多样性（Ecological diversity）.-cell shapes: rods, cocci, spirals, filaments,amorphous, star-shaped, squares,-cell organization: multicellular from pairs and tetrads to filaments, sheets, rosettes, microbia

6、l mats,-cells size: average 1 to 5 microns range 0.1 to 660 microns (Thiomargarita namibiensis , giant sulfur bacteruim in Namibian sediments)Morphological diversity.Dimensions of some bacteriaSmall bacteria Bacteroides spp 0.1 0.15-0.13 m Bordetella pertussis 0.2-0.3 0.5-1.0 m Mycoplasma spp 0.1 -

7、0.25 m dia Medium bacteria Bacillus spp 0.7-0.8 2-3 m E. coli 0.4-0.7 1-3 m S. aureus 0.8-1.0 m dia Large Bacteria Anabaena spp 4-5 m Achromatium spp 5 100 m .Chemotrophs:energy is obtained from chemicals lithotrophs: inorganic chemicals (sulfur, iron, hydrogen) -autotrophs: carbon is obtained by fi

8、xing CO2 (sulfur-reducing Archaea, methanogens) -heterotrophs: carbon is obtained from organic compounds (sulfur-reducing Archaea) organotrophs and heterotrophs: carbon and energy are obtained from organic chemicals (heterotrophs, E.coli, pathogens)Metabolic diversityPhototrophs: energy is obtained

9、from light heterotrophs: carbon is obtained from organic compounds (halophilic Archaea and others) autotrophs: carbon is obtained by fixing CO2 (most cyanobacteria, photosynthetic bacteria).Ecological diversity-salinity: from fresh water to marine and hypersaline environments (Dead sea and the Great

10、 Salt Lake, halophiles)-temperature: from 12 to 113oC (Pyrolobus) and beyond (121oC)-pH: from 0 (Thiobacillus thiooxidans) to 13 (Plectonema nostocorum) pH 0 is 1M HCl-redox potential: from 450mV (methanogens)to + 850mV (iron bacteria)-hydrostatic pressure: from 1 to 1400 atm (barophiles).1.4 微生物多样性

11、影响因素（微生物多样性影响因素（Drive factors）v营养物质营养物质v环境因素环境因素v生物关系生物关系.Diversity arises from the balance between speciation and extinction rates. Diversity theories“one reason for the high genomic diversity observed in prokaryotic communities in soil and sediments is the large populations of organisms and the ca

12、pacity to accumulate large numbers of mutations.”How does “abundance” influence this balance?.1.5 微生物多样性价值微生物多样性价值v科研价值科研价值v经济价值经济价值v生态价值生态价值.Estimates of biodiversity are problematic.CultivatedCultivatedUncultivated (16S Uncultivated (16S rDNArDNA clone diversity)clone diversity).传统平板培养方法（传统平板培养方法（

13、traditional culture-dependent methods）群落水平生理学方法（群落水平生理学方法（community level physiological profile，CLPP）生物标记法（生物标记法（Biomakers）分子微生物学方法（分子微生物学方法（Molecular microbial diversity ）.传统培养分离方法是将定量样品接种于培养基中，在一定的传统培养分离方法是将定量样品接种于培养基中，在一定的温度下培养一定的时间，然后对生长的菌落计数和计算含量，并温度下培养一定的时间，然后对生长的菌落计数和计算含量，并通过在显微镜下观察其形态构造，结合培养

14、分离过程生理生化特通过在显微镜下观察其形态构造，结合培养分离过程生理生化特性的观察鉴定种属分类特性。培养分离方法采用配比简单的营养性的观察鉴定种属分类特性。培养分离方法采用配比简单的营养基质和固定的培养温度，还忽略了气候变化和生物相互作用的影基质和固定的培养温度，还忽略了气候变化和生物相互作用的影响，这种人工环境与原生境的偏差使得可培养的种类大大减少响，这种人工环境与原生境的偏差使得可培养的种类大大减少(仅仅占环境微生物总数的占环境微生物总数的0.1%10%)。而且，此方法繁琐耗时，不能。而且，此方法繁琐耗时，不能用于监测种群结构的动态变化。用于监测种群结构的动态变化。2.1 传统平板培养方法

15、传统平板培养方法.0714212835020406080100120土壤细菌Hha I酶切数量Number of soil bacteria digested by Hha ITypes of OTUsOTUs种类LBWSACSEA 不同培养基培养的细菌种系型丰度趋势线不同培养基培养的细菌种系型丰度趋势线 .07142128020406080100土壤细菌Hha I酶切数量Number of soil bacteria digested by Hha ITypes of OTUsOTUs种类048h4896h96192h 不同培养时间培养的细菌种系型丰度趋势线不同培养时间培养的细菌种系型丰度趋

16、势线 .该方法最初由美国的该方法最初由美国的BIOLOG公司于公司于1989年开发成功，最初应用于纯种微生年开发成功，最初应用于纯种微生物鉴定，至今已经能够鉴定包括细菌、酵母菌和霉菌在内的物鉴定，至今已经能够鉴定包括细菌、酵母菌和霉菌在内的2000多种病原微生物和多种病原微生物和环境微生物。环境微生物。这种方法是基于微生物群落对这种方法是基于微生物群落对95种不同碳源的利用度来描述群落中微生物的种不同碳源的利用度来描述群落中微生物的动态变化。其具体做法是：利用由动态变化。其具体做法是：利用由95孔不同单一孔不同单一C源和源和1个对照孔组成的个对照孔组成的Biolog微平微平板系统，将土壤溶液接

17、种到每一个微平板孔中，在一定的温育时间内，由于不同微板系统，将土壤溶液接种到每一个微平板孔中，在一定的温育时间内，由于不同微生物对不同单一生物对不同单一C源利用程度和强度不一样而发生不同生化代谢反应，最终使得每源利用程度和强度不一样而发生不同生化代谢反应，最终使得每一个孔的溶液呈现出不同程度的颜色，微平板中每一孔的颜色变化可以通过酶标仪一个孔的溶液呈现出不同程度的颜色，微平板中每一孔的颜色变化可以通过酶标仪测定和记录下来，这样便可得到土壤微生物特有的测定和记录下来，这样便可得到土壤微生物特有的“代谢指纹代谢指纹”(Metabolic Fingerprint)。根据土壤微生物的代谢指纹图谱，结合

18、有关的计算机分析软件和己。根据土壤微生物的代谢指纹图谱，结合有关的计算机分析软件和己有的菌种库资料，可以得到某些微生物的分类鉴定，对一般细菌的鉴定可以精确到有的菌种库资料，可以得到某些微生物的分类鉴定，对一般细菌的鉴定可以精确到种，有的甚至精确到种以下的分类单元种，有的甚至精确到种以下的分类单元 。2.2 BIOLOG 鉴定系统鉴定系统.磷脂是构成生物细胞膜的主要成分，约占细胞干重的磷脂是构成生物细胞膜的主要成分，约占细胞干重的5%。在。在细胞死亡时，细胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅速的代谢掉，因细胞死亡时，细胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅速的代谢掉，因此它只在活细胞中存在，十分适合于微生物群

19、落的动态监测。另一此它只在活细胞中存在，十分适合于微生物群落的动态监测。另一个重要因素是脂肪酸具有属的特异性，特殊的甲基脂肪酸已经被作个重要因素是脂肪酸具有属的特异性，特殊的甲基脂肪酸已经被作为微生物分类的依据。磷脂脂肪酸谱图分析法首先将磷脂脂肪酸部为微生物分类的依据。磷脂脂肪酸谱图分析法首先将磷脂脂肪酸部分提取出来，然后用气相色谱分析，得出分提取出来，然后用气相色谱分析，得出PLFA谱图。谱图。2.3 脂肪酸谱图法脂肪酸谱图法(PLFAs、WCFA-FAMEs和其它方法和其它方法).荧光原位杂交是在荧光原位杂交是在20世纪世纪80年代末在放射性原位杂交技术的年代末在放射性原位杂交技术的基础上

20、发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧光标记取以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。它根据已知微生代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。它根据已知微生物不同分类级别上种群特异的物不同分类级别上种群特异的DNA序列，以利用荧光标记的特异序列，以利用荧光标记的特异寡聚核苷酸片段作为探针，与环境基因组中寡聚核苷酸片段作为探针，与环境基因组中DNA分子杂交，检测分子杂交，检测该特异微生物种群的存在与丰度。该方法的特点是可以进行样品该特异微生物种群的存在与丰度。该方法的特点是可以进行样品的原位杂交，应用于环境中特定微生物种群鉴定、种群

21、数量分析的原位杂交，应用于环境中特定微生物种群鉴定、种群数量分析及其特异微生物跟踪检测，是目前在分子微生物生态学领域应用及其特异微生物跟踪检测，是目前在分子微生物生态学领域应用比较广泛的方法之一。比较广泛的方法之一。2.4 荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术（fluorescent in situ hybridization, FISH）. FISH样本的制备样本的制备探针的制备探针的制备探针标记探针标记杂交杂交（染色体显带）（染色体显带）荧光显微镜检测荧光显微镜检测结果分析结果分析.采用限制性内切酶识别双链采用限制性内切酶识别双链DNA分子中特异的短列，在特定分子中特异的短列，在特定的位点将的

22、位点将DNA切开，来自不同个体基因组的含同源序列的酶切片切开，来自不同个体基因组的含同源序列的酶切片段具有不同的长度。通过常规的电泳分离，不同长度的片段停留段具有不同的长度。通过常规的电泳分离，不同长度的片段停留在不同的位置，即形成了限制性片段长度多态性指纹图谱，在不同的位置，即形成了限制性片段长度多态性指纹图谱， ARDRA(扩增扩增rDNA限制性分析限制性分析)和和T-RFLP(末端末端RFLP)都是由都是由RFLP发展而来的方法。发展而来的方法。T-RFLP法在法在PCR扩增进程中使用荧光标扩增进程中使用荧光标记的引物，因而记的引物，因而PCR产物被末端标记。产物被末端标记。RFLP(A

23、RDRA，RFLP)方方法通常选择法通常选择rRNA(rDNA)的基因作为扩增对象，广泛用于研究土的基因作为扩增对象，广泛用于研究土壤、水体和海洋沉积物等区系微生物群落的结构和多样性。壤、水体和海洋沉积物等区系微生物群落的结构和多样性。2.5 限制性片段长度多态性方法限制性片段长度多态性方法（restriction fragment length polymorphism，RFLP) .环境微生物环境微生物16S rDNA的文库构建的文库构建提取微生物总提取微生物总DNA分离、纯化分离、纯化DNA用通用引物扩增用通用引物扩增16SrDNA酶连、转化构建质粒文库酶连、转化构建质粒文库再以再以M1

24、3引物扩增引物扩增插入质粒中的插入质粒中的rDNA片段片段环境微生物环境微生物群落结构群落结构限制性酶切分析限制性酶切分析归纳分类归纳分类.同样大小的同样大小的DNA序列由于含有的碱基不同，各片段的序列由于含有的碱基不同，各片段的Tm值值也就不同。甚至一个碱基对的不同，都会引起也就不同。甚至一个碱基对的不同，都会引起Tm很大的差异，很大的差异，DGGE或或TGGE就是应用这种差异来区分不同的基因序列。这种就是应用这种差异来区分不同的基因序列。这种电泳方法在聚丙烯酰胺中加入甲酰胺（电泳方法在聚丙烯酰胺中加入甲酰胺（DGGE），从正极到负极），从正极到负极梯度递加，或是形成温度梯度（梯度递加，或是

25、形成温度梯度（TGGE）。电泳中的）。电泳中的DNA到达它到达它的变性甲酰胺浓度或温度时，双链部分解开，造成泳动速度发生的变性甲酰胺浓度或温度时，双链部分解开，造成泳动速度发生变化，从而达到分离效果。变化，从而达到分离效果。 2.6 变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳（TGGE）.2.7 高通量测序方法高通量测序方法2005年，在国际顶级的学术期刊年，在国际顶级的学术期刊Nature上，来美国上，来美国454生命科学生命科学公司的公司的Margulies等人发表文章介绍了一种快速简单的测序方法：结合了等人发表文章介绍了一种快速简单的测序方法：结合了

26、DNA扩增的乳胶系统（扩增的乳胶系统（emulsion system）和皮升大小焦磷酸）和皮升大小焦磷酸（pyrophosphate）为基础的测序方法）为基础的测序方法焦磷酸测序（焦磷酸测序（pyrosequencing）方法。发明者宣称，这种测序方法比传统的方法。发明者宣称，这种测序方法比传统的Sanger测序的方法快测序的方法快100倍，假倍，假如利用这种方法来进行人类基因组的测序，那么在如利用这种方法来进行人类基因组的测序，那么在100多天内就可以完成。多天内就可以完成。在在2005年年底，年年底，454公司的研究人员将这种崭新的测序技术转化成了商品化公司的研究人员将这种崭新的测序技术转

27、化成了商品化的仪器的仪器Genome Sequencer 20 系统，并由罗氏应用科学部独家负责在系统，并由罗氏应用科学部独家负责在全球的销售和技术服务等工作。全球的销售和技术服务等工作。Genome Sequencer 20 系统一经推出，就系统一经推出，就受到了国际上基因组学专家的广泛关注，并在世界各大测序实验室相继成受到了国际上基因组学专家的广泛关注，并在世界各大测序实验室相继成功落户。可以说，随着功落户。可以说，随着Genome Sequencer 20 系统的不断推广应用和升级，系统的不断推广应用和升级，快速基因组测序的时代已经来临，并对整个基因组学的研究将产生巨大的快速基因组测序的

28、时代已经来临，并对整个基因组学的研究将产生巨大的推动作用。推动作用。.1）454测序技术（测序技术（GS FLX系统超高通量测序）系统超高通量测序）454技术以平均序列读长技术以平均序列读长240bp遥遥领先于同系列高通量测序仪，而遥遥领先于同系列高通量测序仪，而序列平均读长在基因组测序拼接过程中至关重要。而且序列平均读长在基因组测序拼接过程中至关重要。而且454 GS FLX 基因基因组测序仪是高性能并行计算机和服务器及配套软件，建立信息处理平台组测序仪是高性能并行计算机和服务器及配套软件，建立信息处理平台与数据库，大大提高生物信息学分析能力；与数据库，大大提高生物信息学分析能力； 拥有超强

29、的功能验证和解析拥有超强的功能验证和解析能力。能力。2）Solexa 高通量测序技术高通量测序技术Solexa 测序技术为新一代革新性技术分子生物学综合技术平台，具测序技术为新一代革新性技术分子生物学综合技术平台，具有高准确性，高通量，高灵敏度，和低运行成本等突出优势有高准确性，高通量，高灵敏度，和低运行成本等突出优势, 该测序技术该测序技术可在每一张芯片获取可在每一张芯片获取 1G 的碱基数据，超过了传统测序仪近百倍的工作的碱基数据，超过了传统测序仪近百倍的工作量。量。Solexa 测序技术为广大用户提供了强大的下一代测序方法，可以同测序技术为广大用户提供了强大的下一代测序方法，可以同时完成

30、传统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学（基因表达时完成传统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学（基因表达及调控，基因功能，蛋白及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究。核酸相互作用）研究。高通量测序方法介绍高通量测序方法介绍. 土壤微生物总土壤微生物总DNA的提取方法的提取方法直接提取法直接提取法能够破坏土壤结构，使团聚体内部的微生物释放出来，能够破坏土壤结构，使团聚体内部的微生物释放出来，是进行随机和非特异性裂解的有效方法是进行随机和非特异性裂解的有效方法l反复冻融；反复冻融；l冰冻煮沸；冰冻煮沸；l玻璃珠匀浆；玻璃珠匀浆；l液氮研磨；液氮研磨；l超声波破碎等。超声波破碎等。.B. 间接提取法间接提取法Coarse particlesPellet (microbial cell)Soil colloid Soil.C.直接提取法与间接提取法比较直接提取法与间接提取法比较直接提取法：直接提取法：优点：优点：DNA产量高，偏嗜度低；产