原核表达载体的重要调控元件

1、原核表达载体的重要调控元件启动子启动子是 DNA 链上一段能与 RNA 聚合酶结合并起始 RNA 合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。由于细菌 RNA 聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核音酸序列组成，对 mRNA 的合成极为重要。在转录起始点上游 510bp 处，有一段由 68 个碱基组成，富含 A 和 T 的区域，称为 Pribnow 盒，又名 TATA 盒或10 区。来源不同的启动子，Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游 35bp 处，有一段由

2、10bp 组成的区域，称为-35 区。转录时大肠杆菌 RNA 聚合酶识别并结合启动子。-35 区与 RNA 聚合酶 s 亚基结合，-10区与 RNA 聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近 DNA 被解旋形成单链，RNA 聚合酶使第一和第二核昔酸形成磷酸二酯键，以后在 RNA 聚合酶作用下向前推进，形成新生的 RNA 链。原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有 Lac（乳糖启动子卜 Trp（色氨酸启动子卜 Tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子）、IPL（l 噬菌体的左向启动子）、T7 噬菌体启动子等。（1）Lac 启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是 DNA 分子上一段有方向的核音酸序列，由阻

3、遏蛋白基因（LacI）、启动基因（P）、操纵基因（O）和编码 3 个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。Lac 启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过 CAP（catabolitegeneactivationprotein）因子和 cAMP来激活启动子，促使转录进行。负调控则是由调节基因产生 LacZ 阻遏蛋白，该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如 IPTG 可与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与。基因结合，从而解除这种阻遏，诱导转录发生。（2）trp 启动子：它来自大肠杆菌的色氨酸操纵子，其阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性。当缺乏色氨酸时，该启动子开

4、始转录。当色氨酸较丰富时，则停止转录。b-口引噪丙烯酸可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合，解除阻遏蛋白的活性，促使 trp 启动子转录。（3） Tac 启动子：Tac 启动子是一组由 Lac 和 trp 启动子人工构建的杂合启动子，受 Lac 阻遏蛋白的负调节,它的启动能力比 Lac和 trp都强。 其中 Tac1是由 Trp启动子的一 35区加上一个合成的 46bpDNA片段 （包括 Pribnow盒）和 Lac 操纵基因构成，Tac12 是由 Trp 的启动子-35 区和 Lac 启动子的-10 区，加上 Lac操纵子中的操纵基因部分和 SD 序列融合而成。Tac 启动子受 IPTG 的诱

5、导（4）1PL启动子：它来自 l 噬菌体早期左向转录启动子，是一种活性比 Trp 启动子高 11 倍左右的强启动子。IPL启动子受控于温度敏感的阻遏物 cIts857。在低温(30C)时，cIts857 阻遏蛋白可阻遏 PL启动子转录。在高温(45C)时，cIts857 蛋白失活，阻遏解除，促使 PL启动子转录。系统由于受 cIts857 作用，尤其适合于表达对大肠杆菌有毒的基因产物，缺点是温度转换不仅可诱导 PL启动子，也可诱导热休克基因，其中有一些热休克基因编码蛋白酶。如果用 1 噬菌体 cI+溶源菌，并用丝裂霉素 C 或紊咤酮酸进行诱导，可缓解这一矛盾。（5）T7 噬菌体启动子：它是来自

6、 T7 噬菌体的启动子，具有高度的特异性，只有 T7RNA 聚合酶才能使其启动，故可以使克隆化基因独自彳 I 到表达。T7RNA 聚合酶的效率比大肠杆菌 RNA 聚合酶高 5 倍左右，它能使质粒沿模板连续转录几周，许多外源终止子都不能有效地终止它的序列，因此它可转录某些不能被大肠杆菌 RNA聚合酶有效转录的序列。这个系统可以高效表达其他系统不能有效表达的基因。但要注意用这种启动子时宿主中必须含有 T7RNA 聚合酶。应用 T7 噬菌体表达系统需要 2 个条件：第一是具有 T7 噬菌体 RNA 聚合酶，它可以由感染的 l 噬菌体或由插入大肠杆菌染色体上的一个基因拷贝产生；第二是在一个待表达基因上

7、游带有 T7噬菌体启动子的载体。2 .SD 序列1974 年 Shine 和 Dalgarno 首先发现，在 mRNA 上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子 AUG 和一段位于 AUG 上游 310bp 处的由 39bp 组成的序列。这段序列富含嗯吟核昔酸，刚好与 16SrRNA3。末端的富含嗑咤的序列互补，是核糖体 RNA 的识别与结合位点。以后将此序列命名为 Shine-Dalgarno 序列，简称SD 序列。它与起始密码子 AUG 之间的距离是影响 mRNA 转录、翻译成蛋白的重要因素之一，某些蛋白质与 SD 序列结合也会影响 mRNA 与核糖体的结合， 从而影响蛋白质的翻译。 另外， 真核基因的第二个密码子必须紧接在 ATG 之后，才能产生一个完整的蛋白质。3 .终止子在一个基因的 3 铢端或是一个操纵子的 3 铢端往往有特定的核音酸序列，且具有终止转录功能，这一序列称之为转录终止子，简称终止子(terminator)。转录终止过程包括：RNA 聚合酶停在 DNA 模板上不再前进，RNA 的延伸也停止在终止信号上，完成转录的 RNA 从 RNA 聚合酶上释放出来。对 RNA 聚合酶起强终止作用的终止子在结构上有一些共同的特点，即有一段富含 A/T 的区域和一段富含 G/C 的区域，G/C富含区域又具有回文对称结构。这段终止子转录后形成的 RNA