与众不同的核酸酶Cas13a：编辑RNA的新CRISPR平台及其进展-精选文档

1、与众不同的核酸幅Cas13a:RNA的新CRISPRF台及其进展DOI:10.14088/jki.issn0439-8114.2021.02.001:TheCRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)platformisanexcellentgenomeeditingplatform,inwhich,thenovelnucleaseCas13a(CRISPR-associatedprotein13a)caneditDNAandRNA.ThisnewplatformcouldfulfillDNAorRNAdetectio

2、nwithmolarsensitivityandsingle-basemismatchspecificity,andmeanwhilebeextendedtofinedetectofviruses(evenCloserelativesofZikaandDenguestrains)andbacteria,monitorearlycancer,withthesimpletechnicalmanipulationandawiderangeofapplicationpotentials,whichcouldbeanotherexcellenttoolofgenomicediting.Herethecu

3、rrentprogressaboutCas13asystemwasoverviewed.1结构中科院生物物理研究所王艳丽课题组通过结构和生化解析了Leptotrichiashahii(Lsh)细菌中C2c2与crRNA(CRISPR-RNA的二元复合物3.2?的电镜结构、C2c2与crRNA(CRISPR-RNA及其targetRNA三元复合物3.08?的晶体结构,以及C2c2在自由状态下的晶体结构,揭示了LshC2c2通过两个独立的活性结构域来发挥其两种不同的RNAB切活性图17ocrRNA的结合会引起C2c2蛋白的构象变化,这种变化很可能使其更稳定地与crRNA的结合,进而对识别靶标RN砒

4、着重要作用.Knott等8报道了毛螺科菌LachnospiraceaebacteriumcrRNA结合Cas13aLbaCas13a的2.0?晶体结构.研究人员通过结构分析和生化试验,定义了直接负责crRNA突变的Cas13a催化残基,而且这种蛋白上外源靶向RN阳异性序列的发现也解释了Cas13a核酸酶活化的构象门控图2.2Cas13a与Cas9功能机制特点比拟与Cas9一样,Cas13a也能容忍crRNA与目标序列之间的单个错配,不过假设存在2个错配,切割效率就大大降低.它的PFS序列相当于PAM序列位于间隔区的3端,由A、U或C碱基组成图3.综合Cas13a特点见表1,二者的区别在于Cas

5、13a切割对象是RNA而Cas9靶向切割DNACas13a是一种双组件系统,只需要一条crRNA介导,而Cas9需要crRNA和tracrRNA;Cas13a对crRNA的加工并非必须,尤其是Cas13a靶标单链RNA9;从结构上来看,Cas13a含有两个HEPN吉构域,而Cas9用HNH和RuvC结构域来切割DNA目标.HEPN吉构域对Cas13a切割RNA目标是必需的；Cas13a遗传上可编码,这意味着可将必要元件合成为DNA专递到组织和细胞中.Cas13a还有一个特别之处,那就是Cas13a一旦识别并切割由crRNA序列指定的靶标RNA它就转入了一种酶促“激活状态,这时它将结合并切割其他

6、的非靶标RNA而不管它们是否与crRNA同源,或是否存在PFS,与Cas9截然不同.Cas13a蛋白实质上是细菌自我武装的哨兵,在检测到其靶标后攻击所有RNA对于细菌而言,这种特性是有意义的.假设细菌被噬菌体感染,它能够激活程序性细胞死亡或休眠状态,以限制感染在整个群体中的传播.作者将这称为附属活性,这种特性可被用作一个自动放大检测器,开发成为一种低成本的诊断法10.3应用3.1 用于检测浓度极低的单RN6子和单DN心子利用附属活性,Gootenberg等10在这套系统里塞入了一种带有RNA勺荧光标志物,平时它不会发出荧光,一旦Cas13a到处剪切,被荧光标记的RNAa会被切开,让它发出明亮的

7、光辉.也就是说,只要设计好适宜的向导RNA并提供Cas13a与荧光标志物,那么一旦这套系统识别到匹配的RNAff列,就会发出荧光,告诉研究人员找到靶标了.这套系统的灵敏度到达了50fM(1fM=10-15mol/L).尽管这样,研究人员依然没有满足,想要把灵敏度进一步提升到阿摩尔级(aM10-18mol/L).为了到达这一目标,引入JamesCollins教授的技术“等温扩增,进一步降低了对初始核酸浓度的需求,增加放大步骤有助于检测灵敏度提升到百万分之一.将这两种技术结合起来的新系统能够检测极低浓度的单RN心子和单DN心子,并能进一步引入冷冻枯燥等应用程序,从而真正构建出一种强大的工具.利用这

8、一技术,可在短短1h内对样品进行检测,还可将其冻存并重构,成本也很低.3.2 用于区分细微差异的病原多个结果都佐证了Cas13a工具能够识别人血清、尿液和唾液中的寨卡病毒RNA并且还可将寨卡病毒与登革热这两种关系相近的病毒区分开,甚至能分辨具有不同耐药突变的肺炎菌株,这些对于准确诊断病情、有效预防疫情爆发而言,有着现实的应用价值10o3.3 用于癌症早期监测在癌症的早期诊断领域,科学家们希望从血液中别离出专属于癌细胞的突变,从而得知癌症是否开始发作.然而,由于血液中有着大量的非癌细胞DNA这一检测过程困难无比.Gootenberg等10试验说明,该平台同样能以阿摩尔级的灵敏度,识别出肿瘤特有的

9、突变.研究人员应用这套系统,成功地鉴定出了人类基因组中的多个单核甘酸多态性(SNP,并能分析出每一个人的特定SNP是纯合还是杂合.这项工具能在患者的血液中寻找到极少量的肿瘤DNA帮助研究人员理解肿瘤的突变如何随着时间推移发生改变.由于到达如此非同寻常的灵敏度,研究人员想到了福尔摩斯(SherlockHolmes),于是把这套系统称为SHERLOCK(Specifichighsensitivityenzymaticreporterunlocking)3.4 用于治疗遗传性疾病3.5 潜在应用与Cas9类似,Cas13a分子中关键残基的突变可以形成核酸酶活性缺失的Cas13adCas13a,它能够

10、结合RN明标但无法切割.人们可利用dCas13a来别离群体中的特定RNAff歹U,或利用荧光标记的dCas13a来研究活细胞中的RNRj工.Cas13a有望继续扩大CRISPR勺应用范围有：添加一些模块到特定RNM列中改变它们的功能译成蛋白质的方式,这将使得它们成为用于大规模筛查及构建合成调控网络的有价值工具；利用C2c2荧光标记RNA冰研究RN刖勺运输和亚细胞定位.此外,Cas13a并不是惟一的一种RNAIE向CRISPR1统,张锋研究组还发现了Cas13b11.像Cas13a一样,Cas13b仅需要单个向导RNAa能找到靶标,并且从遗传学的角度是可编码的.此外,Cas13b能够同时靶向多个RNA专录本.这些特性使得Cas13b更适用于微调基因功能研究12o4Cas13a与RNAi比拟在CRISPRH现之前,RNAi是调节基因表达的理想方法.但Cas13a一大优势就在于其具有更强的特异性,而且这种本身来自细菌的系统对哺乳动物细胞来说并不是内源性的,因此不太可能干扰细胞中天然的转录.相反,RNAi利用内源性机制进行基因敲除,对本身的影响较大.Abudayyeh等13别离得到了Cas13a酶,构建出了一种双质粒RNAlE向CRISP源统,这一系统能在不同的质粒上表