第二章 DNA重组克隆的单元操作

1、质粒质粒RopdimerPRNAIIRNA IIa、在复制起点处，、在复制起点处， RNA II（长（长555个碱基）与质粒个碱基）与质粒DNA形成形成RNA-DNA复合物，复合物，RNA酶酶H可降解可降解RNA II ，露出，露出3自由羟基，自由羟基，质粒复制起始。在该区域还能反向转录形成质粒复制起始。在该区域还能反向转录形成RNA I，I和和II为互为互补的补的RNA。RopdimerPRNAIIRNA IIa) 复制原点区域含有复制原点区域含有37拷贝的长度为拷贝的长度为1722bp的的重复区域，重复区域，R1、R2、R3等。等。b)复制原点附近有一个编码基因复制原点附近有一个编码基因r

2、epA,编码编码RepA蛋白。蛋白。 RepA是双功能的蛋白：是双功能的蛋白： 与复制原点区域的重复序列结合，起始与复制原点区域的重复序列结合，起始DNA的合成；与自的合成；与自身基因的启动子结合，抑制自身的转录。身基因的启动子结合，抑制自身的转录。R7268ApRR1 drd 19ApR CmR SmRSuR KmRpMB3ApRpSF2124ApRpBR312ApR TcRpSC101TcR12pM88pMB9TcR34ColE1566pBR313ApRTcRpBR322ApR TcR78pMB1(b)BamHIpUC182686 bpAprlacZoriGAATTCGAGCTCGGTAC

3、CCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnISmaIXbaISalIPstISphIHindIII无启动子序列无启动子序列报告报告基因基因MCS复制原点选择标记高效启动子高效启动子终止子序列终止子序列核糖体核糖体结合位结合位点点注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如E.coli BL21（DE3） 等AproripGEM-3Z2743 bplacZPT7MCSPSP6超螺旋超螺旋 DNA松弛cccDNA开环DNA核酸内切酶核酸内切酶DNA连接

4、酶连接酶核酸内切酶核酸内切酶DNA促旋酶促旋酶拓扑异构酶拓扑异构酶Upper band containing chromosomal DNA and open plasmid circlesLower band of covalently closed circles plasmid DNAEthidium bromide (EB)电泳方向cccDNAL-DNAOC-DNACKRZ浑浊清亮（左右臂连接） （三段自身连接） （插入片段） 根据噬菌斑的透明度或颜色来进行重组子的筛选根据噬菌斑的透明度或颜色来进行重组子的筛选 cIEcoR I LA 32.7RA10.6gt 10 lac ZLA 1

5、9.9RA21.9EcoR ICharon 16ALac Z EcoR I EcoR IEcoR I BanH I Sal I Sal I BamH I EcoR I MCS MCS Charon 4AEMBL3/4Charon 40Lyse, mixAdd ATP and concatemerized DNAMature phage particlesRF DNAM13mp系列载体系列载体polylinkerlacZIII VI I IV II X V VII IX VIIIM13mp系列载体系列载体polylinkerlacZBlue-white selection pHC796.4 kb

6、柯斯质粒载体柯斯质粒载体pHC79图图由由pBR322质粒质粒DNA与与噬菌体噬菌体DNA的的cos位点及其控制包装作用的序位点及其控制包装作用的序列构成列构成+Cre recombinase protein circularizes injected DNA at the lox P sites. DNA-replicates using plasmid replicon, Plasmid copy number is increased by induction of P1 lytic replicon.Pac extract cleaves at pac site and inserts

7、 DNA into p1 heads. Tails are attachedAllow phage to adsorb to host strain and inject DNA into cre+ host cell.正常酵母人工染色体含有：正常酵母人工染色体含有：* 四膜虫端粒（四膜虫端粒（tel)* 酵母自主复制序列（酵母自主复制序列（ARS)* 酵母着丝点酵母着丝点 (CEN)* 酵母的选择标记酵母的选择标记 (TRP1、URA1)YAC载体载体（一）限制性内切酶的发现已知有两种不同的限制酶都可产生粘性末端：已知有两种不同的限制酶都可产生粘性末端：5-P 端突出：端突出：3-OH 端突

8、出：端突出：Hind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5Hsu I 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5同裂酶（isoschizomers） 有一些来源不同的限制性内切酶能识别并切有一些来源不同的限制性内切酶能识别并切割相同的核苷酸靶序列，这类酶称为同裂酶。割相同的核苷酸靶序列，这类酶称为同裂酶。5TCGATCGA3 5TCGA*TCGA*35AGCTAGCT3 5 A*GCTA*GCT3Taq ITaq IDpn I5ATCGAT3Cla I5GA*TCGAT35ATCGA*TC3o4）部分酶对其识别序列内的碱基是否甲基化， 不影响切割5(C/T/A)ATCGAT(T/A/G)

9、3Cla I二、连接酶二、连接酶1、连接酶：能够催化两条双链、连接酶：能够催化两条双链DNA链之间链之间形成形成3 ， 5磷酸二酯键的酶磷酸二酯键的酶5末端形末端形成成DNA腺腺苷酸复合物苷酸复合物OH3 5PGGTAC-OH P-CC-P HO-CATGG5 33 5GG-OH P-CCCCATGG5 33 5GGTACCCCATGG5 33 5大片段（ Klenow片段）：53 的聚合酶活性，3 5外切核酸酶小片段lDNA聚合酶53OH+ Mg2+ + dATP+TdT53AAAAAAAA53OH53AAAAAAAA+ Co2+ + dATP+TdT53OH+ Co2+ + dATP+Td

10、T53AAAAAAAAA3突出端平端3凹端双酶切反应的原则双酶切反应的原则A、盐浓度要求相似的内切酶可在一个反、盐浓度要求相似的内切酶可在一个反应体系中做双酶切反应应体系中做双酶切反应B、先做低盐反应酶切再做高盐反应的酶、先做低盐反应酶切再做高盐反应的酶切切C、考虑双酶切位点的核苷酸排列、考虑双酶切位点的核苷酸排列5GAATTC3EcoR I低盐、高pH值、过量甘油5AAATTC35GAGTTC31、互补黏性末端之间的连接、互补黏性末端之间的连接n同一限制酶切割位点连接：同一限制酶切割位点连接： 由同一限制性核酸内切酶切割的不同由同一限制性核酸内切酶切割的不同DNA片片段具有完全相同的末端。只

11、要酶切割段具有完全相同的末端。只要酶切割DNA后产生单链突出（后产生单链突出（5突出及突出及3突突出）的粘性末端，同时酶切位点附近的出）的粘性末端，同时酶切位点附近的DNA序列不影响连接，那么，当这序列不影响连接，那么，当这样的两个样的两个DNA片段一起退火时，粘性末端单链间进行碱基配对，然后在片段一起退火时，粘性末端单链间进行碱基配对，然后在DNA连接酶催化作用下形成共价结合的重组连接酶催化作用下形成共价结合的重组DNA分子。具有两个插入方向分子。具有两个插入方向n 两个限制性内切酶切割位点连接：两个限制性内切酶切割位点连接： 只可一种方向插入只可一种方向插入n 同尾酶切割位点连接：发生酶切

12、口的焊死作用同尾酶切割位点连接：发生酶切口的焊死作用五、五、DNA分子重组的方分子重组的方法法DNA 接头接头dATPdTTP同聚物加尾产生粘性末端同聚物加尾产生粘性末端从生物秀网站下载外膜与内膜外膜与内膜间的部分核间的部分核酸酶离开酸酶离开 细胞膨胀细胞膨胀 细胞膜磷酯层形成液晶细胞膜磷酯层形成液晶感受态感受态加入加入DNA羟基磷酸钙羟基磷酸钙-DNA复合物复合物核酸酶不能降解核酸酶不能降解42处理处理膜液晶结构发膜液晶结构发生变化，通透生变化，通透性增加，性增加，DNA进入细胞进入细胞低渗低渗CaCl2溶液溶液供体菌供体菌(待转化的重组质粒待转化的重组质粒的菌株），不能在最小培养的菌株），

13、不能在最小培养基中生长，但抗生素基中生长，但抗生素XR辅助菌辅助菌(含辅助质粒的菌含辅助质粒的菌株），株），不能在最小培养不能在最小培养基中生长，但抗生素基中生长，但抗生素YR受体菌受体菌, 能在最小能在最小培养基中生长培养基中生长在无抗生素在无抗生素的培养基中的培养基中混合培养一混合培养一段时间后段时间后含有含有X+Y的最的最小培养基小培养基BamH IBamH IPst IPst I含有？抗生素的培养基上生长含有？抗生素的培养基上生长正选择只能筛选转化子只能筛选转化子BamH IBamH I含有？抗生素的培养基上生长BamH IBamH I含有氨苄抗生素的培养基上生长BamH IBamH

14、I筛选重组子筛选重组子含有氨苄抗生素的培养基氨苄四环素的培养基？lac Z: -gallactosidase (-半乳糖苷酶半乳糖苷酶，水解乳糖形成半乳糖和葡萄糖）lac Y: lactose permease（半乳糖苷透性酶，运送乳糖透过细菌的细胞壁)lac A: transacetylase（半乳糖苷乙酰转移酶，去除由半乳糖苷透性酶吸收的有毒的硫代半乳糖苷thiogalactoside)lac I: 乳糖阻遏蛋白基因Plac :乳糖代谢结构基因的启动子PI : 阻遏蛋白基因的启动子CAP：代谢激活蛋白结合位点 阻遏蛋白四聚体不仅能被别乳糖结合，也能被与别乳阻遏蛋白四聚体不仅能被别乳糖结合，

15、也能被与别乳糖结构类似的物质如糖结构类似的物质如IPTG(异丙基异丙基-D-硫代半乳糖）结合，硫代半乳糖）结合，这种这种能高效诱导酶的合成，但又不被所诱导的酶分解的分能高效诱导酶的合成，但又不被所诱导的酶分解的分子，称为子，称为安慰性诱导物安慰性诱导物载体载体PucPuc系列（系列（PUC18/19PUC18/19）带有带有E.coli DNAE.coli DNA的短区段，含：的短区段，含： (1) LaczM15(1) LaczM15编码编码半糖苷酶半糖苷酶N N端的端的 146146个个AAAA信息也称信息也称肽；肽； (2)(2)编码区插入一个编码区插入一个MCSMCS并不破坏阅读框，少

16、数几个并不破坏阅读框，少数几个AAAA插入插入到该酶的到该酶的N N端而不影响其功能；端而不影响其功能； (3)Plac(3)Plac可以启动可以启动LaczLacz的的 转录，表达，但受阻转录，表达，但受阻pr.pr.阻遏，阻遏，IPTGIPTG（异丙基硫代（异丙基硫代半乳糖苷）能够去阻遏。半乳糖苷）能够去阻遏。JM103JM103受体菌含受体菌含lacz(c)lacz(c)编码编码半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的 C C端部分端部分互补互补 当载体转入当载体转入JM103 lacz(n)与与lacz(c) lacz(c) 互补，编码互补，编码具有活性酶具有活性酶prpr使底物使底物X-galX-g

17、al生色（生色（5 5溴溴4 4氯氯3 3吲哚吲哚半乳糖苷半乳糖苷产生兰菌落）。产生兰菌落）。当当MCSMCS插入外源插入外源genegene片断时，几乎无一例外产生无片断时，几乎无一例外产生无互补能互补能力的力的 氨基酸片段（插入酶失落）导致白菌落产生。氨基酸片段（插入酶失落）导致白菌落产生。PUC19PlacLacZ(N)MCSJM 103外源基因片段插入外源基因片段插入 白菌落白菌落IPTGlacz(c) X-gal蓝菌落蓝菌落-半乳糖苷酶半乳糖苷酶图图8-5 -互补互补a-互补显色反应（蓝白斑筛选）互补显色反应（蓝白斑筛选）lacZ -半乳糖苷酶半乳糖苷酶-分解半乳糖分解半乳糖iPO调控蛋白调控蛋白-肽段肽段分解分解X-gal产物呈现蓝色产物呈现蓝色诱导剂诱导剂IPTG-半乳糖苷酶