第6章药物的含量测定

1、MicrosoftMicrosoft第六章 药物的含量测定药药分分 制制药药20112011第一第一节节 概概述述药物的含量测定药物的含量测定 评价药物质量的主要指标。运评价药物质量的主要指标。运用化学、物理或生物化学的方法用化学、物理或生物化学的方法和技术，测定药物中主要有效成和技术，测定药物中主要有效成分的含量。分的含量。定定义义药物的含量测定药物的含量测定化学、物理学、生物学方法化学、物理学、生物学方法方方法法 利用某些生物学特性利用某些生物学特性或特殊反应来定性、或特殊反应来定性、定量定量化学反应化学反应如光吸收如光吸收特性、浊特性、浊度度药物的含量测定药物的含量测定基于化学或物理学基

2、于化学或物理学原理的原理的含量测定含量测定。分分两两类类基于生物学原理的基于生物学原理的效价测定效价测定。基基础础生物检定法，微生生物检定法，微生物检定法，酶法。物检定法，酶法。目目标标含量测定。含量测定。含量方法要求含量方法要求n化学原料药（化学原料药（API)API)：根据药物的化学结构、理根据药物的化学结构、理化性质等特点综合考虑适宜的含量测定法。选化性质等特点综合考虑适宜的含量测定法。选用的含量测定法应能准确测试有效成分的含量，用的含量测定法应能准确测试有效成分的含量，其准确度和精密度均高。其准确度和精密度均高。n制剂：制剂：可能时应选用与原料药相同的测定可能时应选用与原料药相同的测定

3、方法，共存药物、辅料、附加剂有干扰时，方法，共存药物、辅料、附加剂有干扰时，可考虑增加预处理或改进方法可考虑增加预处理或改进方法, ,但专属性但专属性要强。要强。 含量表示方法含量表示方法（一）原料药含量的表示法（一）原料药含量的表示法原料药一般以百分含量表示，指样品中被测成分（一般为活原料药一般以百分含量表示，指样品中被测成分（一般为活性物质）的百分含量。一般按干燥品计算。性物质）的百分含量。一般按干燥品计算。药典凡例规定：药典凡例规定： “ “按干燥品（或无水物，或无溶剂）计算按干燥品（或无水物，或无溶剂）计算”时，除另有规定外，应取未经干燥（或未去水，或未去溶时，除另有规定外，应取未经干

4、燥（或未去水，或未去溶剂）的供试品进行试验，并将计算中的取用量按检查项下剂）的供试品进行试验，并将计算中的取用量按检查项下测得的干燥失重（或水分，或溶剂）扣除。测得的干燥失重（或水分，或溶剂）扣除。因此：含量因此：含量% %（干燥品计）（干燥品计）= =直接测得量直接测得量（1-1-干燥失重）干燥失重）（二）药物制剂含量的表示法（二）药物制剂含量的表示法一般以一般以相当于标示量的百分数表示相当于标示量的百分数表示，指一个制剂单，指一个制剂单位中平均含有的药物成分为制剂标准的位中平均含有的药物成分为制剂标准的“规格规格”项规定量的百分数。如：对乙酰氨基酚片，规格项规定量的百分数。如：对乙酰氨基酚

5、片，规格0.5g0.5g，经含量测定测得平均每片含对乙酰氨基酚，经含量测定测得平均每片含对乙酰氨基酚0.45g0.45g，则标示量为，则标示量为90%90%。固体制剂含量测定结果的计算固体制剂含量测定结果的计算 %100% = =标示量标示量每片实测含量每片实测含量含量含量100 平均片重平均片重= = =标示量标示量供试品重供试品重测得量测得量标示量标示量平均片重平均片重供试品重供试品重测得量测得量100 原料药原料药制剂制剂 物质的量 效价 生物学法（基于生物学原理） 药物含量测定方法药物含量测定方法化学法（基于化学原理） 容量分析法、重量分析仪器分析法（基于物理学原理） 光谱法、色谱法具

6、体方法具体方法n容量分析法：容量分析法：包括重量分析法、滴定法（直接、包括重量分析法、滴定法（直接、间接滴定法）间接滴定法）n光谱分析法：光谱分析法：UVUV、IRIR、n色谱分析法：色谱分析法：HPLCHPLC、GCGC第二节、容量分析法第二节、容量分析法 为经典方法，原料药分析常采用。为经典方法，原料药分析常采用。常产生滴定误差，如指示剂和仪器容量常产生滴定误差，如指示剂和仪器容量 特点：特点：n1 1、快速、快速, ,准确（准确（RSD0.2RSD10n103 3 ，n n越越大柱效高大柱效高进样tRh0.5hWh/2Wt7.7.分离度分离度 R2（tR2tR1）/（W1W2）pR1.5

7、 认为分离完全认为分离完全W1W2TR2-tR1（二）基本原理（二）基本原理 待分离物质在两相间进行分配时，在固定相中溶解度较待分离物质在两相间进行分配时，在固定相中溶解度较小的组分，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定相中溶小的组分，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定相中溶解度较大的组分，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达解度较大的组分，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离的目的。到分离的目的。 依固定相与流动相极性的不同，分为正相色谱和反相色谱依固定相与流动相极性的不同，分为正相色谱和反相色谱1.1.正相色谱法正相色谱法 流动相极性小于固定相流动相极性小于固定相一般用极性物质作固定相，非

8、极性溶剂(如苯、正己烷等)作流动相，主要用于分离极性化合物，极性小的组分先流出，极性大的组分后流出。2.2.反相色谱法反相色谱法 流动相极性大于固定相流动相极性大于固定相一般用非极性物质作固定相，极性溶剂(如水、甲醇、己腈等)作流动相，主要用于分离非极性或弱极性化合物，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。（三）固定相和流动相（三）固定相和流动相1.1.固定相固定相 常用化学键合相，分极性和非极性键合相，如十八烷基硅烷键合硅胶（C18或ODS）和辛基硅烷键合硅胶（C8）为最常用的非极性键合相，用于反相色谱法； 氨基和氰基硅烷键合相为常用的极性键合相，用于正相色谱法。2.2.流动相流动相 有机

9、溶剂+水混合一般为色谱纯试剂，经0.45um的微孔滤膜过滤，需脱气处理 （四）仪器的基本结构（四）仪器的基本结构 1.1.色谱柱色谱柱柱管柱管- -不锈钢，填充硅胶和化不锈钢，填充硅胶和化学键合固定相学键合固定相 内径内径4.6mm4.6mm长长15cm15cm、20cm20cm和和25cm25cm的三种，的三种，如安捷伦色谱柱、如安捷伦色谱柱、 WatersWaters色色谱柱、迪马色谱柱等。谱柱、迪马色谱柱等。 2.2.检测器检测器常用紫外检测器常用紫外检测器其次有二极管阵列检测器其次有二极管阵列检测器(DAD)(DAD)荧光检测器荧光检测器示差折光检测器示差折光检测器蒸发光散射检侧器蒸发

10、光散射检侧器电化学检测器和质谱检测器等电化学检测器和质谱检测器等 （五）（五） 系统适用性试验系统适用性试验定义：指用规定的对照品对色谱系统进行试验，定义：指用规定的对照品对色谱系统进行试验，应符合要求。应符合要求。包括包括柱温、柱长、固定相、流动相；理论板数：说明分离过程，色谱柱的塔板数越多，柱效越高； 分离度：应大于1.5；重复性：相对标准偏差应不大于2.0%；等；等； （六）在杂质检查和含量测定中的应用（六）在杂质检查和含量测定中的应用 1.1.内标法（加内标法（加校正因子）校正因子）方法：方法：n内标物内标物+ +对照品对照品对照溶液，进样，测定，计算校正因子对照溶液，进样，测定，计算

11、校正因子。RRssCACAf= =校正因子校正因子CR对照品浓度对照品浓度As内标物峰面积内标物峰面积CS内标物浓度内标物浓度AR对照品峰面积对照品峰面积n供试品供试品+ +内标内标供试品溶液，进样，测定供试品和内标物质供试品溶液，进样，测定供试品和内标物质的峰面积或峰高，计算含量的峰面积或峰高，计算含量f= AS / CSAx /CxCx=f AxAS / CSCx样品浓度样品浓度Ax样品峰面积样品峰面积例例.HPLC.HPLC法测定盐酸阿夫唑嗪片（规格：法测定盐酸阿夫唑嗪片（规格：5mg5mg）的含量：）的含量：取盐酸特拉唑嗪约取盐酸特拉唑嗪约20mg20mg，称定，置，称定，置100ml

12、100ml量瓶中，加流量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，得内标溶液。取盐酸动相溶解并稀释至刻度，摇匀，得内标溶液。取盐酸阿夫唑嗪对照品约阿夫唑嗪对照品约10mg10mg，精密称定，置，精密称定，置10ml10ml量瓶中，量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品储备液，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品储备液，精密取该储备液精密取该储备液1ml1ml，置，置100ml100ml量瓶中，精密加内标溶量瓶中，精密加内标溶液液5ml5ml，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液；另取本品溶液；另取本品2020片，精密称定，研细，精密称

13、细粉片，精密称定，研细，精密称细粉适量（约相当于阿夫唑嗪适量（约相当于阿夫唑嗪10mg10mg），置），置100ml100ml量瓶中，加量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液10ml10ml，置，置100ml100ml量瓶中，精密加内标溶液量瓶中，精密加内标溶液5ml5ml，用流动，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，得样品溶液。分别精密相溶解并稀释至刻度，摇匀，得样品溶液。分别精密取对照品溶液和样品溶液各取对照品溶液和样品溶液各20l20l注入液相色谱仪，记注入液相色谱仪，记录色谱图，按内标法以峰面积计算含量。录色谱图，按内标法以峰面积

14、计算含量。操作：操作：对照品取样为对照品取样为10.1mg10.1mg，2020片重为片重为1.6020g1.6020g，取样细粉称重取样细粉称重158.2mg158.2mg，测得对照品溶液中盐酸阿，测得对照品溶液中盐酸阿夫唑嗪和内标的峰面积分别为夫唑嗪和内标的峰面积分别为54701245470124和和61260126126012，样品溶液中阿夫唑嗪和内标的峰面积分别为样品溶液中阿夫唑嗪和内标的峰面积分别为52199865219986和和6119897861198978，计算本品的含量。，计算本品的含量。 解：解：对照品浓度：对照品浓度：0.0101mg/ml,0.0101mg/ml,内标浓

15、度：内标浓度：0.01mg/mg0.01mg/mgf=(AS/CS)/(AR/CR)=(6126012/0.01)/(5470124/0.0101)(6126012/0.01)/(5470124/0.0101) =1.13 =1.13 CX=fAX/(AS/CS)=1.131.135219986/(6119898/0.0100)5219986/(6119898/0.0100) =0.009735mg/ml =0.009735mg/ml=（0.0097350.00973510010010/158.2)10/158.2)（1.6020/201.6020/20）/5/5100%=98.58% 100

16、%=98.58% 100平均片重平均片重= = =标示量标示量供试品重供试品重测得量测得量含量含量标示量标示量平均片重平均片重供试品重供试品重测得量测得量100例例.HPLC.HPLC法测定单硝酸异山梨酯注射液（规格：法测定单硝酸异山梨酯注射液（规格：5ml:20mg5ml:20mg）的含量：取间三甲氧基苯约的含量：取间三甲氧基苯约20mg20mg，称定，置，称定，置100ml100ml量瓶量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，得内标溶液。中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，得内标溶液。取单硝酸异山梨酯对照品约取单硝酸异山梨酯对照品约8mg8mg，精密称定，置，精密称定，置100ml100m

17、l量瓶中，精密加内标溶液量瓶中，精密加内标溶液5ml5ml，用流动相溶解并稀释至，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，取刻度，摇匀，取20l20l注入液相色谱仪，记录色谱图；注入液相色谱仪，记录色谱图；另取本品另取本品2ml2ml，同法测定，按内标法以峰面积计算含量。，同法测定，按内标法以峰面积计算含量。已知：对照品取样为已知：对照品取样为8.1mg8.1mg，测得对照品溶液中单硝酸，测得对照品溶液中单硝酸异山梨酯和内标的峰面积分别为异山梨酯和内标的峰面积分别为54678245467824和和61258436125843，样品溶液中单硝酸异山梨酯和内标的峰面积分别为样品溶液中单硝酸异山梨酯和内标的

18、峰面积分别为52213455221345和和61228456122845，计算本品的含量。，计算本品的含量。解：f=(AS/CS)/( AR/CR)=(6125843/0.01)/(5467824/0.081)=9.07 CX=fAX/(AS/CS)=9.075221345/(6122845/0.01)=0.07735mg/ml 100装量装量= = =标示量标示量取样量取样量测得量测得量含量含量标示量标示量装量装量取样量取样量测得量测得量100=(0.7735100/5)2/20100%=96.68%2.2.外标法外标法对照液对照液（R）：）： AR CR 供试液供试液（X）：）： AX C

19、XCX CRAX ARCXCR AXAR要求：进样量准确、操作条件稳定要求：进样量准确、操作条件稳定A A总总=Ai=A1+A2+An=Ai=A1+A2+An (%)=Ai / A (%)=Ai / A总总100%100% 例题例题7 7 用气相色谱法检查大豆油的脂肪用气相色谱法检查大豆油的脂肪酸组成，相应于棕榈酸、硬酯酸、油酸、亚油酸组成，相应于棕榈酸、硬酯酸、油酸、亚油酸和亚麻酸的峰面积分别为酸和亚麻酸的峰面积分别为129758129758、4328643286、296522296522、654868654868、9257092570，按峰面积归一化法，按峰面积归一化法，计算上述脂肪酸的百

20、分含量。计算上述脂肪酸的百分含量。 3 3、面积归一化法、面积归一化法二、气相色谱法二、气相色谱法1.1.分离原理分离原理注入进样口的样品经加热气化后，被载气带入色谱柱，注入进样口的样品经加热气化后，被载气带入色谱柱，由于其分配系数的不同进行分离，各组分先后进入检测器，由于其分配系数的不同进行分离，各组分先后进入检测器，信号记录仪、积分仪和数据处理系统记录色谱信号。分配信号记录仪、积分仪和数据处理系统记录色谱信号。分配系数小的组分先流出，分配系数大的组分后流出。系数小的组分先流出，分配系数大的组分后流出。2.2.色谱仪的基本结构色谱仪的基本结构由载气源、进样器、色由载气源、进样器、色谱柱、柱温

21、箱、检测器谱柱、柱温箱、检测器和数据处理系统组成和数据处理系统组成 . .载气（流动相）：载气（流动相）： 如氦、氮和氢等如氦、氮和氢等 . .进样器：直接进样或顶空进样进样器：直接进样或顶空进样 微量注射器微量注射器. . 固定相和载体固定相和载体 色谱柱为色谱柱为填充柱填充柱或或毛细管柱毛细管柱 常用的固定液有常用的固定液有甲基聚硅氧烷甲基聚硅氧烷、不同比例组成的苯基甲基聚、不同比例组成的苯基甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。硅氧烷、聚乙二醇等。毛细管柱填充柱. . 检测器检测器 火焰离子化检测器（火焰离子化检测器（FID)FID)、热导检测器热导检测器(TCD)(TCD)、氮磷检测器（氮磷检测器

22、（NPD)NPD)、火焰光度检测器火焰光度检测器(FPD)(FPD)、电子捕获检测器电子捕获检测器(ECD)(ECD)、质谱检测器质谱检测器(MS) (MS) 1 1 专属性专属性 2 2 线性及其范围线性及其范围 3 3 精密度精密度 4 4 准确度准确度 5 5 检测限检测限 6 6 定量限定量限 7 7 耐用性耐用性一、专属性一、专属性(Specificity)v 指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性。采用的方法能准确测定出被测物的特性。v 分析复杂样品混合物时衡量其分析复杂样品混合物时衡量

23、其是否受到干扰是否受到干扰的一种方法。的一种方法。 A- 对照品对照品B- 样样 品品C- 阴阴 性性二、线性与范围二、线性与范围( (L Linearity inearity A And nd R Rangeange) )v线性：线性：在设计的范围内，测试结果与被测物浓度在设计的范围内，测试结果与被测物浓度呈正比关呈正比关系系的程度。的程度。 vY=a+bx （r0.999) 范围：范围：达到一定精密度、准确度和线性的条件下，测试方达到一定精密度、准确度和线性的条件下，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。法适用的高低限浓度或量的区间。eg.eg.原料药和制剂含量测定，范围应为测试浓度的原料药

24、和制剂含量测定，范围应为测试浓度的80%80%120%120%；制剂含量均匀度检查，范围应为测试浓度的；制剂含量均匀度检查，范围应为测试浓度的70%70%130%130%，根据剂型特点，如气雾剂、喷雾剂，范围可适当放宽；溶出度根据剂型特点，如气雾剂、喷雾剂，范围可适当放宽；溶出度或释放度中的溶出量测定，范围应为限度的或释放度中的溶出量测定，范围应为限度的20%20%1 1、定义：、定义：在规定的测试条件下在规定的测试条件下, ,同一个均匀样品同一个均匀样品经多次测定所得结果彼此符合程度。经多次测定所得结果彼此符合程度。三、精密度三、精密度2 2、表示方法、表示方法： 偏差（偏差（d d）：）：

25、 标准偏差标准偏差(SD):(SD): 相对标准偏差相对标准偏差(RSD):(RSD):idxx=2ixxSn1=SRSD100%x=重复性重复性: : 同一实验室同一实验室, ,同一人多次测定的精密度同一人多次测定的精密度至少用至少用9次测定结果评价：制备三个不同浓度样品，每一浓度次测定结果评价：制备三个不同浓度样品，每一浓度样品测三次。样品测三次。中间精密度中间精密度: : 同一实验室，不同人，不同仪器测定的精密度同一实验室，不同人，不同仪器测定的精密度目的：考察随机变动因素的影响，如日期、分析人员目的：考察随机变动因素的影响，如日期、分析人员重现性重现性: : 不同实验室，不同人测定的精密度不同实验室，不同人测定的精密度当分析方法将被法定标准采用时，应进