微生物实验课件三生化反应一

1、实验三、细菌的鉴定技术生物化学鉴定（一） 生化反应 不同细菌所具有的酶系统各不同，对营养物质的利用能力各异，它们在代谢的过程中所产生的代谢产物也不相同，通常用化学或生物化学方法检测细菌的代谢产物，有助于细菌属、种的鉴定。这种利用生化方法来鉴别细菌的实验，称之为细菌生化反应，是鉴定细菌的重要方法。生化反应设计的原理1.细菌具有不同酶系统可以分解不同的培养基中不同的底物产生各种不同的代谢产物。1）若是酸性或碱性的代谢产物使不同的培养基中酸碱指示剂发生颜色的变化。2）某些代谢产物可以和培养基中特异成分呈显色反应。（硫化氢试验）3）某些代谢产物可以和试剂呈特异的颜色反应（靛基质试验）2.利用细菌合成的

2、存在于自身的酶，直接在体外和相应的底物作用呈特异的反应。（触酶试验）3.利用一些化学物质可以特异的抑制细菌的生长，鉴定细菌。（Optochin,杆菌肽） 蛋白水解酶（胞外酶） 肽酶（胞内酶）蛋白质 蛋白眎 蛋白胨 肽类 氨基酸 NH3 脱氨酶 氨基酸 脱羧酶 胺类+CO2【目的要求】 掌握鉴别细菌常用的生化培养基的原理、操作的方法和结果判定。【器材和试剂】1.菌种 大肠埃希菌铜绿假单胞菌变形杆菌肺炎克雷伯杆菌2.培养基 蛋白胨水，枸橼酸盐培养基，克氏双糖铁培养基；蔗糖、葡萄糖氧化发酵管、苯丙氨酸脱氨酶，葡萄糖酸盐，鸟氨基酸脱羧酶，赖氨酸脱羧酶，氨基酸脱羧酶对照管、尿素，硝酸盐，丙二酸盐，硫化氢

3、、葡萄糖磷酸盐蛋白胨水等微量生化反应管。3.试剂 甲基红试剂，VP试验甲液、乙液，靛基质试剂，10%三氯化铁试剂，班氏试剂，硝酸盐还原试剂甲液、乙液，氧化酶试剂，无菌的液体石蜡。【步骤和方法】一、碳水化合物的代谢试验1.糖发酵试验2.葡萄糖氧化-发酵（O/F试验）3.克氏双糖铁试验（KIA）4.甲基红试验5.V-P（Voges-Proskauer）试验1.糖发酵试验1）培养基：a.不同糖（醇、苷）发酵培养基。b.不同的用途做成不同的形状的培养基。c. 蔗糖微量发酵管。2）原理：不同细菌含有不同的分解糖（醇、苷）的酶，对它们的分解能力也各不相同，有的不分解，有的分解后仅产酸，有的分解后产酸产气。

4、产生的酸性物质使培养基pH下降，导致培养基中的酸碱指示发生颜色的变化，常用的指示剂有酚红、中性红、溴甲酚紫、溴麝香草酚蓝等。3）操作方法：将 号菌以无菌操作，用接种针接种于蔗糖微量发酵管中，35 培养1824h观察结果。4）结果：a.不分解糖，培养基颜色与接种前相比没有颜色的变化，记录时以“-”表示。b.若细菌分解糖产酸，使酸碱指示剂溴甲酚紫由淡紫色变黄色 （如为溴甲酚紫其变色范围在pH5.2 pk6.1 6.8（黄淡紫色紫红）。记录时以“+”表示。c.若细菌分解糖产酸又产气，可在半（固）固体培养基观察到气泡产生，也可使培养基出现裂隙，或把培养基的底部顶起等现象。在液体培养基倒置的试管中可观察

5、到试管内气泡。记录时以“ ”表示糖发酵试验5）应用：鉴定细菌常用的生化反应。主要用于肠杆科、肠球菌属等细菌鉴定。6）注意事项a.用砂轮切割微量反应管时，左手拿微量培养基，右手拿砂轮压在培养基上1/3或1/2处用力旋转培养基切割。从切割处掰开培养基，小心不要把手割破。（后面的微量培养基亦是）b.接种针灭菌后放凉再用，以免烧死细菌。将细菌在较低液面的管壁处充分研磨，然后直立培养基。2.葡萄糖氧化-发酵（O/F试验）1）培养基：两支葡萄糖氧化-发酵半固体微量培养基（O/F管）2）原理：细菌在分解葡萄糖的代谢过程中，根据对氧分子需求的不同，可将待检菌分为氧化型、发酵型和产碱型三类。氧化型细菌仅在有氧环

6、境中分解葡萄糖；发酵型细菌在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖；产碱型细菌在有氧或无氧环境中都不能分解葡萄糖。3）方法：将或者号菌以无菌操作，用接种针分别以穿刺的接种于两支O/F半固体微量培养基中，一支培养基加无菌液体石蜡23滴，高度不少于1cm（F、封闭管），另一支不加液体石蜡（O、开放管），35 培养1824h观察结果。4）结果：细菌仅以氧化方式分解葡萄糖产酸，在O管中，产生的酸使酸碱指示剂溴麝香草酚蓝由绿色变黄 （BTB其pk7.0，变色范围在pH6.07.6（黄绿蓝），记录结果“O”型 。细菌以发酵方式分解葡萄糖，O和F管两管全部变黄，记录结果“F”型。 O和F管两管都不变色，为产碱型，记

7、录结果“-”型或者“”。5）应用：此试验可区分细菌（尤其用于G-b）对葡萄糖的代谢类型。主要用于 G-b：非发酵细菌群大多为氧化型仅少数产碱型，而肠杆菌科、弧菌科细菌均为发酵型。G+c:葡萄球菌属为F，微球菌属为O型。6）注意事项a.用砂轮切割微量生化反应管时，左手拿微量管，右手拿砂轮，旋转切割。从切开处掰开试管时，小心不要把手割破。b.接种针灭菌后放凉再用，以免烧死细菌。接种时从培养基中心用接种针做半固体穿刺。c.两支O/F管，其中一支加液体石蜡已形成一个相对厌氧环境，石蜡和培养基接触不要产生气泡。不加石蜡管是一个有氧环境。7）质控菌：发酵型：大肠埃希菌，ATCC25922。氧化型：铜绿假单

8、胞菌，ATCC27853。不利用：粪产碱杆菌1）培养基：克氏双糖铁琼脂（KIA） 主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。其共同的生化反应特征为：a.都能以发酵的方式分解葡萄糖。b.氧化酶全部阴性。c.都能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。KIA培养基可以观察到细菌仅发酵分解葡萄糖；同时发酵分解乳糖和葡萄糖；以及是否分解含硫氨基酸的能力。3、克氏双糖铁试验（KIA）（复合培养基）2）原理：a.培养基中乳糖和葡萄糖的比例为101，指示剂为酚红，其 pk7.8 ，变色范围在pH6.48.2（黄红）， 而KIA的pH为7.4，若产少量的酸就可导致其颜色改变。b.培养基斜面部分为有氧环境而底层（高层）与空气隔绝是相对厌氧的

9、环境。c.如接种的细菌既能发酵分解葡萄糖又能分解乳糖，因此能产生大量的酸，使斜面与底层均成黄色。（产酸以“+/+”表示）d.如该细菌只发酵葡萄糖而不发酵乳糖，培养基内仅有0.1%葡萄糖可产酸。开始的812h时，产生的酸足以引起斜面和底层的颜色变黄。但在接下来的时间里，葡萄糖被完全消耗，斜面部分所生成的酸可因接触空气而氧化挥发，细菌在有氧的条件下开始分解蛋白质，氧化降解氨基酸，产生碱性化合物，1824h整个斜面又转换成碱性颜色红色（产碱以表示）。底层呈相对缺氧状态，细菌发酵葡萄糖所生成的酸类物质不被氧化而氨基酸降解产生的碱性化合物不足以中和形成的酸，所以培养基仍为黄色。以。以“/+”表示。e.细

10、菌分解糖除了产酸还可以产气时，在底层还可看到有气泡或裂口现象，以 表示f. 细菌如分解培养基含硫氨基酸产生硫化氢，硫化氢则与培养基中枸橼酸铁铵（柠檬酸铁铵）中的亚铁离子形成黑色的硫化亚铁。3）方法：将号菌用接种针以无菌操作接种于克氏双糖铁琼脂培养基，先做底层穿刺，距管底5mm左右停下，再从原路退回，然后做斜面的划线接种，于35 培养1824h。4）结果：若细菌为发酵乳糖和葡萄糖产酸，斜面和底层均呈黄色，以+/ +，若分解糖产酸产气则以（ / ）表示。如细菌仅发酵葡萄糖而不发酵乳糖，斜面仍为红色，底层变黄。以/+ 表示斜面和底层仍为红色为非发酵菌株。以-/-表示。产硫化氢菌株可使底层或斜面产生黑

11、色反应，以+/ +（ / ）加H2S或/+ （ / ）加H2S表示。5）应用：用于G-b鉴别，主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。6）质控菌大肠埃希菌，ATCC25922，上、下全黄。奇异变形杆菌，上红下黄并且产硫化氢。铜绿假单胞菌，ATCC27853，上下红，表面产碱。结果观察及记录：斜面产酸产气/底层产酸产气表示： /如大肠埃希菌。结果观察及记录：斜面产碱/底层产酸表示 ：/+如志贺菌属结果观察及记录：斜面产碱/底层产酸产硫化氢表示 ：/+加H2S如变形杆菌属。结果观察及记录：斜面不变/底层不变表示 ：/如非发酵菌群中铜绿假单胞菌。4、甲基红试验1）培养基：葡萄糖磷酸盐蛋白胨水微量生化培养基2）原

12、理：细菌发酵分解培养基中的葡萄糖形成丙酮酸，丙酮酸进一步分解成甲酸、乙混合酸，产生大量酸，使培养基pH7.2降至4.5以下时加入甲基红试剂而变紫红色（阳性）。若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其它物质（如醇、酮、气体和水等），则培养基的酸度仍在pH6.2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，是为阴性。3）方法：待号菌无菌操作接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，于35 培养1824h。4）结果：在培养基中加入甲基红指示剂（甲基红+95%乙醇+蒸馏水）2 3滴，立即观察，呈现紫红色为阳性，桔黄色为阴性。5）应用：主要用于肠杆菌科的鉴别，如大肠埃希菌（+），产气肠杆菌（-）6）质控菌：阳性菌：大肠

13、埃希菌，ATCC25922； 阴性菌：产气肠杆菌。甲基红试验5、V-P（Voges-Proskauer）试验1）培养基：葡萄糖磷酸盐蛋白胨水微量生化培养基2）原理：某些细菌发酵分解葡萄糖产生丙酮酸，如丙酮酸脱羧产生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境中，被空气中的氧氧化成为二乙酰，二乙酰进而与培养基内蛋白胨中的精氨酸所含的胍基起作用，生成红色的胍缩二乙酰，则v-p试验为阳性。试验时加入-萘酚可加速此反应。3）方法：待号菌接种于葡萄糖蛋白胨水微量培养基中，于35 培养1824h。4）结果：加入A液（6%-萘酚酒精溶液）和B液（40%KOH）各一滴，摇匀后，静止10min观察结果。出现红色为阳性。

14、否为阴性。5）应用：本试验常与甲基红试验一起使用，因为前者阳性的细菌，后者通常为阴性。6）注意事项：滴加V-P试剂A液和B液后需摇匀，静置10min观察结果。7）质控菌：阳性菌：阴沟肠杆菌； 阴性菌：大肠埃希菌，ATCC25922。葡萄糖发酵形成丙酮酸后的不同代谢途径葡萄糖丙酮酸大量混合酸pH降至4.5以下 甲基红试剂培养基变紫红乙酰甲基甲醇乙酰甲基甲醇二乙酰二乙酰KOH+O2培养基变红培养基变红 脱羧二、蛋白质和氨基酸的代谢试验1.吲哚（靛基质）试验2.硫化氢试验3.尿素分解试验4.苯丙氨酸脱氨酶试验5.氨基酸脱羧酶试验1、吲哚（靛基质）试验1）培养基：蛋白胨水液体培养基。2）原理：某些细菌

15、具有色氨酸酶，能分解培养基蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚，吲哚能与对位二甲氨基苯甲醛作用，生成红色的玫瑰吲哚。3）方法：将号 菌以无菌操作用接种环接种于蛋白胨水液体培养基中，35 培养1824h。4）结果：沿试管壁慢慢加入吲哚试剂数滴，静置半分钟观察结果，试剂与培养物两者液面交界处出现玫瑰红色为阳性，无色为阴性。5）应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。6）注意事项a.熟练掌握液体培养基的接种。b.加入吲哚试剂后，不要摇动培养基，若摇动可是红色化合物扩散以致不清晰。7）质控菌阳性菌：大肠埃希菌，ATCC 25922；阴性菌：肺炎克雷伯菌，ATTCC 27236。靛基质试验2.硫化氢试验1）培养基：硫化

16、氢微量生化培养基2）原理：有些细菌能分解培养基含硫氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸）生成硫化氢，遇铅或亚铁离子生成黑色硫化铅或硫化亚铁沉淀。3）方法：将菌用接种针以无菌操作接种于上述培养基中，35 培养1824h。4）结果：培养基变黑色为阳性，无变化为阴性。5）应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。在肠杆菌科细菌中沙门菌属（副伤寒沙门菌及50%猪霍乱沙门菌除外）、爱德华菌、弗劳地枸橼杆菌（78%）、变形杆菌属的细菌为阳性，其它菌属为阴性。6）质控菌：阳性菌：普通变形杆菌，ATCC13315；阴性菌：大肠埃希菌，ATCC25922。3.尿素分解试验1）培养基：尿素微量生化反应管2）原理：某些细菌能产生尿素酶

17、，将尿素分解，生成大量的氨和二氧化碳，使培养基呈碱性，从而使酸碱指示剂酚红变红。3）方法：将菌以无菌操作接种于上述培养基中，35 培养1824h。4）结果：培养基变红色为阳性 ； 阴性：不变色。5）应用：主要用于肠杆菌科细菌、布鲁杆菌、新型隐球菌等细菌的鉴定。6）质控菌：阳性：普通变形杆菌，ATCC 13315， 阴性：大肠埃希菌，ATCC 25922。4.苯丙氨酸脱氨酶试验1）培养基：苯丙氨酸微量生化培养基2）原理：若细菌产生苯丙氨酸脱氨酶，可使苯丙氨酸脱去氨基生成苯丙酮酸，苯丙酮酸可与10%三氯化铁试剂反应，生成绿色的化合物。3）方法：将菌用接种针以无菌操作接种于上述培养基中，35 培养1

18、824h。4）结果：沿管壁滴加入10%三氯化铁试剂23滴后，立即观察结果。试剂和培养物中间出现绿色环者为阳性，阴性为黄色。 。5）应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。在肠杆菌科细菌中变形杆菌属、普罗维登斯菌属、摩根菌属均为阳性，其它肠杆菌科细菌为阴性。6）注意事项： 加入试剂后，立刻观察结果。若延长时间观察，颜色会退去；使劲晃动培养基也可颜色消散。7）质控菌：阳性菌：普通变形杆菌，ATCC13315；阴性菌：大肠埃希菌，ATCC25922。5、氨基酸脱羧酶试验1）培养基：微量赖氨基酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶试验管和氨基酸对照管。2）原理：细菌凭借其特异脱羧酶作用于培养基中相应氨基酸的羧基，以产生胺类

19、物质和CO2的反应过程。脱羧作用的结果使培养基pH移向碱侧，使指示剂溴甲酚紫由淡紫色变紫红色。脱羧的过程需要在厌氧环境进行，以防止产生胺类物质被氧化，故接种完后培养基需封无菌的液体石蜡。3）方法：将菌用接种针以无菌操作接种于赖氨基酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶和氨基酸对照培养基中后，三支培养基均需加入无菌液体石蜡23滴，于35 培养1824h，观察结果。4）结果：对照管应呈黄色，测定管呈紫红色为阳性；对照管呈黄色，测定管也呈黄色为阴性。若对照管仍呈淡紫色无变化则试验无意义，不能作出判断。5）应用：主要用于肠杆菌科细菌及其他兼性厌氧菌的鉴定。6）注意事项：a.每次均需做氨基酸对照b.接种完毕，必须封液体

20、石蜡。7）质控菌 阳性菌 阴性菌赖氨酸脱羧酶 迟缓爱德华 弗劳地枸橼酸杆菌鸟氨酸脱羧酶 产气肠杆菌 弗劳地枸橼酸杆菌精氨酸脱羧酶 鼠伤寒沙门菌 普通变形杆菌氨基酸脱羧酶试验结果判断 试验管颜色 对照管颜色 结果判断 黄色 黄色 阴性 紫红色 黄色 阳性 无颜色变化 无颜色变化 无意义三、碳源和氮源利用试验1.丙二酸盐试验2.枸橼酸盐试验3.葡萄糖酸盐试验1.丙二酸盐试验1）培养基：丙二酸盐（钠）微量生化培养基。2）原理：某些细菌可利用培养基中的丙二酸钠作为惟一碳源，将其分解成碳酸钠，导致培养基碱性增强，使指示剂溴麝香草酚蓝（BTB）呈蓝色反应。3）方法：将号菌以无菌操作接种于上述培养基中，35

21、 培养1824h。4）结果：阳性：培养基由绿色变为蓝色；阴性：培养基不变色。5）应用：肠杆菌科细菌及其他兼性厌氧菌鉴定。如肺炎克雷伯菌 ， 阳性；丙二酸盐阴性枸橼酸杆菌为阴性。6）质控菌：阳性菌：肺炎克雷伯菌 ， ATTCC27236；阴性菌：丙二酸盐阴性枸橼酸杆菌。2.枸橼酸盐试验1）培养基：枸橼酸盐固体斜面培养基2）原理：某些细菌利用培养基中枸橼酸钠作为惟一的碳源而获能量，同时也能利用培养基中铵盐作为惟一的氮源，这样的细菌可在枸橼酸盐培养基上生长，分解枸橼酸钠、铵盐分别为碳酸钠和氨，使培养基变碱，从而使指示剂BTB由绿色变蓝。枸橼酸盐利用试验原理枸橼酸盐枸橼酸盐铵盐铵盐碳酸盐碳酸盐氨氨培养

22、基培养基pH升高升高溴麝香草酚蓝溴麝香草酚蓝 呈碱性变色呈碱性变色 培养基变蓝培养基变蓝培养基培养基3）方法：将号菌以斜面划线接种于上述培养基中，35 培养1824h。4）结果：斜面上有细菌生长，且培养基由绿色变为蓝色为阳性；无细菌生长，颜色不变色为阴性。5）应用：用于G-b鉴别 ，主要用于肠杆菌科属间的鉴别。 肺炎克雷伯菌 （+），大肠埃希菌 （-）。6）质控菌 阳性菌： 肺炎克雷伯菌 ，ATCC27236； 阴性菌： 大肠埃希菌 ，ATCC25922。3.葡萄糖酸盐试验1）培养基：葡萄糖酸盐微量培养基2）原理：某些细菌利用培养基中葡萄糖酸盐作为惟一碳源时，可将葡萄糖酸钾氧化分解成-酮基葡萄

23、糖酸，-酮基葡萄糖是一种还原性物质，可将班氏试剂的蓝色硫酸铜还原成为黄色的氢氧化亚铜，进而形成砖红色的氧化亚铜沉淀。 3）方法：将号菌接种于上述培养基中，35 培养1824h。4）结果：往培养基中，加入等量班氏试剂，于沸水中水浴10min。产生黄-橙色沉淀为阳性，蓝色为阴性。 5）应用：肠杆菌科属间的鉴别。肺炎克雷伯（+）， 大肠埃希菌（-）6）注意事项：a.因要往培养基中加入等量班氏试剂，所以微量培养基要留得适当长些。b.一定要在沸水中水浴，时间要达到10mim。7）质控菌阳性菌：肺炎克雷伯， ATCC 27236；阴性菌：大肠埃希菌， ATCC 25922 。四、各种酶类试验1.氧化酶试验

24、（OE）2.硝酸盐还原试验（代替氧作为呼吸酶系统中的终末受体）1.氧化酶试验（OE）1）原理：氧化酶又称细胞色素氧化酶，是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶，在需氧呼吸链中可以把电子（氢）传递给氧。具有细胞色素氧化酶细菌，可使细胞色素C氧化，氧化型的细胞色素C可将1%盐酸四甲基对苯二胺氧化成蓝色的醌类化合物或者将1%盐酸二甲基对苯二胺氧化成红色的醌类化合物2）试剂：1%盐酸四甲基对苯二胺或1%盐酸二甲基对苯二胺。3）方法：滤纸法：取洁净滤纸一小块，做两次对折后形成一角，用此角分别沾取和菌少许，然后滴加1滴1%盐酸二甲基对苯二胺试剂。4）结果 ：立刻观察结果，阳性立刻显呈红色，继而逐渐加深，阴性不变

25、色。5）应用：主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌群（假单胞菌）的鉴别。铜绿假单胞菌（+） ， 大肠埃希菌（-）。6）注意事项：a.避免用生锈的铁接种环，否则易出现假阳性；b.氧化酶试剂在空气中见光易氧化，需避光冷藏保存，需经常更新配置。c.注意不要污染滤纸。d.不要使用含葡萄糖培养基上生长的菌落，因为它的发酵作用会抑制氧化酶的活性。7）质控菌：阳性菌：铜绿假单胞菌 ， ATCC27853；阴性菌：大肠埃希菌， ATCC25922。2、硝酸盐还原试验1）培养基：硝酸盐微量生化培养基2）原理：某些细菌能还原培养基中的硝酸盐，生成亚硝酸盐、氨和氮等。如细菌将硝酸盐还原为亚硝酸盐，生成的亚硝酸盐与醋酸作用

26、生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸（A试剂）作用，成为偶氮苯磺酸，后者再与-萘胺（B试剂）结合为红色的N- -萘胺偶氮苯磺酸。有的细菌能使硝酸盐或亚硝酸盐还原为氮，如铜绿假单胞菌，生成气体氮或氧化氮，称为脱硝化或脱氮化作用。3）方法：将号菌接种于上述培养基中，35 培养1824h。4）结果：将A、B试剂等量加入培养基内，混合后观察结果。阳性者立刻或10秒内显红色；颜色不变阴性。5）应用：本试验在细菌鉴定中广泛应用。大肠埃希菌 （+）， 硝酸盐阴性不动杆菌（-）。6）注意事项：阴性结果有两种可能a.细菌不能将硝酸盐还原为亚硝酸盐（真正的阴性）b.细菌可将硝酸盐或将亚硝酸盐继续还原为氨和氮等（假阴性）。c.这两者的鉴别：向原来的阴性培养基中加入锌粉，锌离子能还原硝酸盐为亚硝酸盐，与硝酸盐还原试剂试剂作用显红色，若显红色，证明培养基有硝酸盐的存在，说明细菌不能还原硝酸盐为亚硝酸盐，是真正的阴性。若不出现红色，表示硝酸盐已被还原为氨和氮。7）质控菌：阳对照性菌：大肠埃希菌 ，ATCC 25922；阴性对照菌：硝酸盐阴性不动杆菌，ATCC15