植物染色体原位杂交

1、(AT，GC)一、荧光原位杂交一、荧光原位杂交二、基因组原位杂交二、基因组原位杂交 三、原位三、原位PCR四、引物原位杂交技术四、引物原位杂交技术五、原位杂交结合显带标记技术五、原位杂交结合显带标记技术六、原位杂交结合免疫组织化学的双标记技术六、原位杂交结合免疫组织化学的双标记技术七、电镜原位杂交技术七、电镜原位杂交技术八、整体荧光原位杂交技术八、整体荧光原位杂交技术九、九、DNA纤维荧光原位杂交纤维荧光原位杂交 fiber-FISH一、荧光原位杂交一、荧光原位杂交 (Fluorescence (Fluorescence in situin situ Hybridization) Hybrid

2、ization) 是原位杂交技术大家族中的一员，因其所用是原位杂交技术大家族中的一员，因其所用探针被荧光物质探针被荧光物质标记标记（间接或直接）而得名，基本原理是荧光标记的核酸探（间接或直接）而得名，基本原理是荧光标记的核酸探针在变性后与已变性的靶核酸在退火温度下复性；通过显微针在变性后与已变性的靶核酸在退火温度下复性；通过显微镜观察荧光信号可在不改变被分析对象（镜观察荧光信号可在不改变被分析对象（即维持其原位即维持其原位）的）的前提下对靶核酸进行分析。前提下对靶核酸进行分析。 DNADNA荧光标记探针是其中最常用的一类核酸探针。利用此探荧光标记探针是其中最常用的一类核酸探针。利用此探针针可对

3、组织、细胞或染色体中的可对组织、细胞或染色体中的DNADNA进行染色体及基因水平进行染色体及基因水平的分析的分析。 二、基因组原位杂交二、基因组原位杂交 (Genome in situ Hybridization)三、原位三、原位PCR 原位原位PCRPCR技术的基本原理，就是将技术的基本原理，就是将PCRPCR技术的高效扩增与原技术的高效扩增与原位杂交的细胞定位结合起来，从而在组织细胞原位检测单位杂交的细胞定位结合起来，从而在组织细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定的拷贝或低拷贝的特定的DNADNA或或RNARNA序列。序列。 原位原位PCRPCR技术的待检标本一般先经化学固定，以保持组织细技术

4、的待检标本一般先经化学固定，以保持组织细胞的良好形态结构。细胞膜和核膜均具有一定的通透性，胞的良好形态结构。细胞膜和核膜均具有一定的通透性，当进行当进行PCRPCR扩增时，各种成分，如引物，扩增时，各种成分，如引物，DNADNA聚合酶，核苷聚合酶，核苷酸等均可进入细胞内或细胞核内，以固定在细胞内或细胞酸等均可进入细胞内或细胞核内，以固定在细胞内或细胞核内的核内的RNARNA或或DNADNA为模板，于原位进行扩增。为模板，于原位进行扩增。 扩增的产物一般分子较大，或互相交织，不易穿过细胞膜扩增的产物一般分子较大，或互相交织，不易穿过细胞膜或在膜内外弥散，从而被保留在原位。这样原有的细胞内或在膜内

5、外弥散，从而被保留在原位。这样原有的细胞内单拷贝或低拷贝的特定单拷贝或低拷贝的特定DNADNA或或RNARNA序列在原位以呈指数极扩序列在原位以呈指数极扩增，扩增的产物就很容易被原位杂交技术检查。增，扩增的产物就很容易被原位杂交技术检查。 四、引物原位杂交技术四、引物原位杂交技术 是通过退火一个是通过退火一个寡核苷酸寡核苷酸DNA DNA 引物引物到制备在载玻到制备在载玻片上的染色体的变性片上的染色体的变性 DNA DNA 上上 , ,用渗入用渗入 的标记核的标记核苷酸在原位进行酶促延长并进行检测的染色体标苷酸在原位进行酶促延长并进行检测的染色体标记技术记技术 染色体原位杂交简单流程图染色体原

6、位杂交简单流程图 探针探针 靶子靶子1.分离分离DNA 1. 染色体的制片准备染色体的制片准备2.标记标记 2. 杂交前处理杂交前处理3.变性变性 3.变性变性 4. 杂交杂交 5.杂交后处理（解离非特异性结合的双链，杂交后处理（解离非特异性结合的双链，除去未杂交的探针）除去未杂交的探针） 6.杂交体的检测（杂交杂交体的检测（杂交DNA呈现颜色呈现颜色A,未未杂交的呈现颜色杂交的呈现颜色B）单链单链DNA1 1制片在制片在6060烘箱中干燥过夜烘箱中干燥过夜2 2用用100ul100ulmlml的的RNaseA(2SSCRNaseA(2SSC配制配制) )，3737小时，小时，2SSC2SSC

7、漂去盖漂去盖片，片，2SSC32SSC35 5分钟洗涤，分钟洗涤，7070-95-95一一100100乙醇脱水，每乙醇脱水，每级级3 3分钟。分钟。3 3用用0.010.01Pepsin(10mMHCIPepsin(10mMHCI配制配制) )，3737，20-4020-40分钟，分钟，1 1PBS2PBS25 5分钟。分钟。4 41 1甲醛甲醛(50MmMgCl(50MmMgCl2 2，1XPBS1XPBS配制配制) )于室温下固定于室温下固定5 5分钟，分钟，2SSC32SSC35 5分钟。分钟。rDNA 在高等真核生物中，核糖体是合成蛋白质的场所。一个完整的在高等真核生物中，核糖体是合成

8、蛋白质的场所。一个完整的核糖体由核糖体由60S、40S大小亚基组成，构成核糖体亚基的主要成分是大小亚基组成，构成核糖体亚基的主要成分是核糖体核糖体-RNA(rRNA)与蛋白质的复合物。与蛋白质的复合物。 其中其中rRNA有有4种类型，即种类型，即18SrRNA、5.8S rRNA、28S rRNA和和5S rRNA。编码这几种。编码这几种rRNA的基因有的基因有2种，一种为种，一种为45S rDNA，另一种为另一种为5S rDNA。 45S rDNA 45S rDNA是高度保守串联重复序列有几千拷贝数，特异是高度保守串联重复序列有几千拷贝数，特异定位于染色体的定位于染色体的核仁组织区核仁组织区

9、(Nucleolar Organizing (Nucleolar Organizing Region,NOR)Region,NOR)，细胞形态学上显示为次缢痕，其远端是随体细胞形态学上显示为次缢痕，其远端是随体(satellite)(satellite)。 其编码区的保守性和非编码区的多态性是研究动植物系统其编码区的保守性和非编码区的多态性是研究动植物系统发育与进化的一个有用标记发育与进化的一个有用标记，而且由于该基因为高度重复序列，而且由于该基因为高度重复序列，在近缘物种中发生着位于染色体上的位点以及同一位点基因拷在近缘物种中发生着位于染色体上的位点以及同一位点基因拷贝数多少的变化，因而通过

10、贝数多少的变化，因而通过rDNA-FISHrDNA-FISH技术对其在染色体上分技术对其在染色体上分布的位置、位点以及拷贝数多少进行比较研究，可以确定近缘布的位置、位点以及拷贝数多少进行比较研究，可以确定近缘物种的亲缘进化关系及起源。物种的亲缘进化关系及起源。 而而5S rDNA5S rDNA虽然也是串联重复序列，但其并不位于核仁组虽然也是串联重复序列，但其并不位于核仁组织区上。织区上。四、洗脱和信号检测四、洗脱和信号检测 7 7杂交制片用杂交制片用2SSC2SSC漂洗去盖片漂洗去盖片，0.10.1SDS(2SSCSDS(2SSC配配制制)373)3735 5分钟，分钟，0.10.1SDS(0

11、SDS(02 2SSCSSC配制配制) 373) 3735 5分分钟，钟，2SSC2SSC室温下冲洗室温下冲洗2 2次，甩干制片。次，甩干制片。 8 8加加50ul50ul片片5 5BSA(4SSCBSA(4SSCTeween20Teween20配制配制) )，加盖片，加盖片，3737封阻封阻3030分钟。分钟。 9 9甩干封阻液甩干封阻液( (制片不能见干制片不能见干) )，加，加30ul30ul片片AlUi-DIG-FITCAlUi-DIG-FITC或或Anti-DIG-RhodamineAnti-DIG-Rhodamine抗体抗体20ug20ugmlml溶于含溶于含5 5BSABSA的的

12、1XPBS1XPBS中中) )，加盖片，加盖片，3737温育温育1 1小时。小时。1010在在1XPBS1XPBSTeween20(0Teween20(02 2) )中，中，373X5373X5分钟，用分钟，用PI(2ugPI(2ugml,1ml,1PBSPBS配制配制)30ul/)30ul/片衬染片衬染7 7分钟或用分钟或用DAPI(2ugDAPI(2ugm1)m1)衬衬染染3 3分钟，分钟，1 1PBS3PBS33 3分钟洗去衬染剂，甩干，分钟洗去衬染剂，甩干，用抗荧光衰用抗荧光衰减剂减剂(Vectashied)(Vectashied)封片封片。 甘薯甘薯GISH45srDNA(45srD

13、NA(黑麦黑麦) ) 黑麦间期核黑麦间期核 玉米玉米 A A为杂交前核型；为杂交前核型； B B为同一核型杂交后结果为同一核型杂交后结果 玉米间期核玉米间期核 A A为杂交前间期核；为杂交前间期核；B B为杂交后结果为杂交后结果 豆角 A为杂交前核型； B为同一核型杂交后结果 豆角间期核 A为杂交前间期核；B为杂交后结果 水稻水稻 A A为杂交前核型；为杂交前核型； B B为同一核型杂交后结果为同一核型杂交后结果 水稻间期核水稻间期核 A为杂交前间期核；为杂交前间期核；B为杂交后结果为杂交后结果 白菜白菜 A为杂交前核型；为杂交前核型； B为同一核型杂交后结果为同一核型杂交后结果 芋头间期核芋头间期核 A为杂交前间期核；为杂交前间期核；B为杂交后结果为杂交后结果 荔枝 菜花西葫芦黄瓜（津春四号）黄瓜（津优一号）黄瓜（津优一号）间期核黄瓜（津优一号）间期核黄瓜（津优一号）间期核黄瓜（津优一号）间期核水稻核悬液涂片（水稻核悬液涂片（Giemsa染色）染色）PI染色示平行状的染色示平行状的DNA纤丝纤丝BAC1在水稻在水稻