蛋白质电泳分析

1、蛋白质电泳与分析Protein electrophoresis analysis目录 1 电泳技术发展简史 2 电泳的基本原理 3 电泳技术分类 4 电泳技术的应用 5 影响电泳迁移率的因素 6 常用的电泳方法 7 电泳仪器1 电泳技术发展简史 1809年俄国物理学家首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。 1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。 1937年瑞典Uppsala大学的Tise

2、lius对电泳仪器作了改进，创造了Tiselius电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是由白蛋白及、球蛋白组成的，由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。1 电泳技术发展简史 1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进行过研究。 从本世纪50年代起，特别是1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物质（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法 1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶

3、作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的新时代。1 电泳技术发展简史 30多年来，聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度：即“电泳纯”（一维电泳一条带或二维电泳一个点）的标准分析鉴定方法，至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段，即“Last Check”。 由80年代发展起来的新的毛细管电泳技术，是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展，己受到人们的充分重视2 电泳的基本原理 电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要

4、的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。正正极极负极负极带负电带负电粒子粒子带带正正电电粒子粒子3 电泳技术分类3.1 区带电泳3.2 界面电泳3.3 等速电泳3.4 等点聚集电泳3.5 毛细管电泳3 电泳技术分类一 原理醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维素薄膜作为支持物的电泳方法。带电颗粒在电场

5、力作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。由于各种蛋白质都有特定的等电点，如将蛋白质置于pH值低于其等电点的溶液中，则蛋白质将带正电荷而向负极移动。反之，则向正极移动。因为蛋白质分子在电场中移动的速度与其带电量、分子的形状及大小有关，所以，可用电泳法将不同的蛋白质分离开来。3 电泳技术分类二 实验材料、仪器及试剂1材料：健康人血清或鸡血清2仪器：电泳仪 电泳槽3试剂：（1）醋酸纤维素薄膜；（2）pH8.6 巴比妥缓冲液（离子强度0.060.07）：取巴比妥0.83克，巴比妥钠6.38克，加蒸馏水加热溶解后，定容至500ml。（3）染色液：取氨基黑10 B 0.5克，溶于50ml甲醇中

6、，再加冰醋酸10ml，蒸馏水40ml混匀。（4）漂洗液：95%乙醇4.5ml，冰醋酸 5ml，蒸馏水50ml混合。（5）透明液：95%乙醇80ml，冰醋酸20ml混合3 电泳技术分类三、实验方法1准备薄膜：将切割整齐的 2.56cm的薄膜条，浸入巴比妥缓冲液中浸透后，取出，用吸水纸吸去多余缓冲液。2点样：仔细辩认薄膜的粗糙面与光滑面，在粗糙面距离薄膜一端1.5cm处，用铅笔轻轻划一条直线。用玻棒蘸上血清样品，涂于盖玻片边缘处（边缘长度应比膜条宽度窄），将此边缘按压在直线上。注意：样品应点在薄膜的粗糙面一侧。待血清完全渗入薄膜后，将膜面翻转，点样面（粗糙面）朝下，置电泳槽中，薄膜点样端放于负极一

7、侧。3电泳：打开电源，调节电压 110130V，电流0.40.6m A/cm宽，电泳时间4560分钟，电泳完毕后，关闭电源。3 电泳技术分类4染色漂洗：将薄膜从电泳槽中取出，直接浸入染色液中约5分钟，再转入漂洗液中反复浸洗34次，直至背景颜色脱净为止。此时，正常血清蛋白在薄膜上显示出五条区带。从前端至点样处的方向分别为清蛋白、1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白及-球蛋白。5定量测定：时可将膜条用滤纸压平吸干，按区带分段剪开，分别浸在体积 0.4mol/L氢氧化钠溶液中，并剪取相同大小的无色带膜条作空白对照，进行比色。或者将干燥的电泳图谱膜条放入透明液中浸泡23分钟后，取出贴于洁净玻璃板上，干燥后

8、，即为透明薄膜图谱，可用光密度计直接测定。4 电泳技术的应用电泳技术主要分离各种有机物和无机盐；也可用于分析某种物质纯度；还可用于分子量测定。电泳技术与其他分离技术（如层析法）结合，可用于蛋白质的分析，“指纹法”就是电泳与层析法的结合产物。用免疫原理测试电泳结果，可提高对蛋白质的鉴别能力。电泳与酶学技术结合发现了同工酶，从而对酶的催化和调节功能有了更深入的了解。所以电泳技术在医用科学中是一项重要的技术。5 影响电泳迁移率的因素5 5.1 .1 迁移率迁移率: : 是指带电颗粒在单位电场下泳动的速度。 5 5.2 .2 迁移率的影响因素迁移率的影响因素: : 内在因素 外在因素5.2.1 影响迁

9、移率的内在因素w 所带静电荷的多少所带静电荷的多少迁移率与表面电荷成正比。w 大小和形状大小和形状直径小而接近于球形，则在电场中泳动速度快。w DNADNA构象构象一般迁移速率超螺旋环状线状DNA单链开环。5.2.2 影响迁移率的外在因素1 1 电场强度: :电场强度是指单位长度（每一厘米）支持物体上的电位降，它对泳动速度起着十分重要的作用。当电压在500V以下，电场强度在 2-10v/cm 时为常压电泳。电压在 500V 以上，电场强度在20-200V/cm 时为高压电泳。一般，电场强度越高，带电颗粒移动速度越快 2 2 溶液的pHpH值 ：溶液的pH决定被分离物质的解离程度和质点的带电性质

10、及所带净电荷量。溶液的pH离pl越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移率越大。因此在电泳时，应根据样品性质，选择合适的pH值缓冲液。3 3 溶液的离子强度：电泳液中的离子增加会使电泳迁移率降低，原因是带电的离子会吸引相反符号的离子聚集在其周围，相成一个与运动粒子符号相反的离子氛（ionic atmosphere），它使该离子向相反的方向运动，从而降低了该粒子的迁移率。 5.2 影响迁移率的外在因素4 4 温度的影响 ：电泳过程中由于通电产生焦耳热，热对电泳有很大的影响。温度每升高1，迁移率约增加2.4%。为降低热效应对电泳的影响，可控制电压或电流，或在电泳系统中安装冷却散热装置5 5 支持物的影响

11、 ：对支持物的要求一般是均匀和吸附力小，否则电场强度不均匀，影响区带的分离，实验结果及扫描图谱无法重复。6 6 电渗：电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗（electro-osmosis）。其产生的原因是固体支持物多孔，且带有可解离的化学基团，因此常吸附溶液中的正离子或负离子，使溶液相对带负电或正电。应尽可能选择低电渗作用的支持物以减少电渗的影响。6 常用的电泳方法6.1 6.1 纸电泳和醋酸纤维素薄膜电泳6.2 6.2 琼脂糖粘胶电泳6.3 6.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳6.4 6.4 等电聚焦电泳6.5 6.5 双向电泳6.6 6.6 免疫电泳6.7 DNA6.7 DNA序列测定6

12、常用的电泳方法聚丙烯酰胺凝胶电泳（英语：sodium dodecyl sulfate polsodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresisyacrylamide gel electrophoresis，简称SDS-PAGESDS-PAGE）作用：用于分离蛋白质和寡核苷酸。 作用原理：聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶及SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGESDS-PAGE）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。而SDS-PAGESDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由shapiroshapiro于19671967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。6 常用的电泳方法6.1 6.1 纸电泳和醋酸纤维素薄膜电泳6.2 6.2 琼脂糖粘胶电泳6.3 6.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳6.4 6.4 等电聚焦电泳6.5 6.5 双向电泳6.6 6.6 免疫电泳6.7 D