绿色荧光蛋白标记铜绿假单胞菌生物膜形成的动态观察及结构定量分

1、绿色荧光蛋白标记铜绿假单胞菌生物膜形成的动态观察及结构定量分         作者：陈波曼 余加林 刘官信 胡琳燕 李芳 杨华 【摘要】 目的 探讨铜绿假单胞菌细菌生物膜(biofilm，BF)形成发展过程中空间立体结构变化，以及BF形成过程中与其生物学行为之间的相互联系。方法 体外建立6h和1、3及6d等4个时间组铜绿假单胞菌PAO1菌株BF模型，通过绿色荧             &

2、#160;              作者：陈波曼 余加林 刘官信 胡琳燕 李芳 杨华【摘要】【关键词】  生物膜； 铜绿假单胞菌； 定量分析； 结构    ABSTRACT  Objective  To quantify the sequential development of biofilm spatial structure in biofilm process with Image Structu

3、re Analyer (ISA) software, which will provide assistant to further research on the biological behavior of biofilm.  Methods  P.aeruginosa PAO1 biofilm model in vitro was constructed on glass slice and biofilm development was monitored in different time intervals (6 hours, 1 day, 3 days and

4、 6 days). The fluorescence images stack of different layer in biofilm model were obtained by confocal laser scanning microscopy (CLSM), based on fluorophores from PAO1 with green fluorescent protein (GFP) genetically tagged. Quantitative parameters describing biofilm spatial structure could be acqui

5、red after the image information was calculated by ISA software.  Results  The PAO1 biofilm process was investigated successfully by CLSM after genetically tagged with GFP. The quantitative data from ISA software showed that the thickness of biofilm accumulated during biofilm growth, the ra

6、te was more obvious during the first 3 days than the latter 3 days (19.6m vs. 6.1m); meanwhile the areal porosity (AP) decreased from 0.98±0.01 at 6h to 0.92±0.02 at 6d, the average diffusion distance (ADD) increased slightly from 1.00±0.009 at 6h to 1.06±0.027 at 6d; the textura

7、l entropy (TE) increased from 0.7±0.08 at 6h to 4.3±0.09 at 6d.  Conclusions  The ISA software could provide useful information of bacterial biofilm spatial structure in PAO1 biofilm process. Quantifying bacterial biofilm structure permitsed correlating biofilm development with b

8、iofilm performance.    KEY WORDS  Biofilm;  Pseudomonas aeruginosa;  Quantitative analysis;  Structure    长久以来，人们对细菌的认识停留在浮游态水平上，但自然界中99%的细菌以生物膜(biofilm，BF)的形式存在。细菌BF是细菌为适应生存环境黏附惰性或活性材料表面形成的一种与浮游细胞相对应的生长方式，具有环境适应能力更强，抵抗吞噬细胞作用，逃避宿主免疫，尤其耐药性极强等生物学特性，而BF

9、的许多特性均与其特殊形态结构有关。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pa)是我国医院和社区获得性感染及重症监护病房感染的重要条件致病菌，近年来研究证明，该菌极易形成BF1，临床上，有BF表型的Pa往往引起难以治愈的严重感染。以往研究多采用光镜、扫描或透射电镜等观察细菌BF结构，但样本在脱水、固定、染色等处理过程中易发生结构扭曲及关系改变。本实验通过建立体外PaO1菌株BF模型，结合绿色荧光蛋白(GFP)标记技术，运用激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscopy，CLSM)摄取BF发展成熟各阶段不同层面的图像，所获图片堆经图象结

10、构分析(image structure analyer，ISA)软件分析，获得PAO1菌株BF发展过程相关空间结构变化的数据，以期实现对细菌BF的无损伤观察，并对BF空间结构的定量化分析进行了初步探索。    1  材料和方法    1.1  试剂和菌株    铜绿假单胞菌PAO1菌株(本实验室保存)，pGFPuv质粒(Clontech公司)，质粒DNA小量提取试剂盒(日本BioFlux公司)，限制型内切酶EcoRI和HindIII(宝生物公司)，ISA软件(美国Montana州立大学

11、Haluk Beyenal教授提供)。    (1)PAO1菌株电感受态制备  参考单志英等2实验方法，将过夜增菌的PAO1菌株转接于50ml SOB培养基中，37，200r/min振荡培养；A600值为0.7左右时中止培养；2，6000r/min离心15min；菌体沉淀依次用等体积、1/2体积、1/5体积的0.3mol/L冰浴蔗糖溶液重新悬浮，洗涤菌体；2，6000r/min离心15min，最后根据菌体多少加入不同体积的0.3mol/L蔗糖溶液将菌体混匀；分装成每管100l，直接用于电转化。    (2)pGFPuv质粒转

12、化和转化菌株筛选  感受态细胞100l，质粒约50ng，加入预冷的0.1cm电转化杯中；在BioRad电转化仪上(设置电压1.5kv，电容25F，电阻200)进行电击5ms；将转化体系加入37温浴的800l SOC培养基中，37，100r/min振荡复苏1h；取100l菌液涂布筛选培养基，37，16h18h；在筛选培养基上生长，且紫外灯下有绿色荧光的菌落即为实验需要的转化菌株。    (3)转化菌株中质粒提取和酶切电泳鉴定  挑取表达强绿色荧光的转化菌株单菌落，接种LBroth培养液，37振荡培养过夜；按照BioFlux公司质粒提取试剂盒产品说

13、明进行质粒的小量提取；0.8%琼脂糖凝胶电泳；对照pGFPuv质粒图谱进行鉴定。用EcoRI和HindIII行双酶切，反应温度为37；反应体系为HindIII 1l，EcoRI 1l，10×M缓冲液2l，提取质粒17l，作用12h；0.8%琼脂糖凝胶电泳。    (4)pGFPuv转化菌株建立BF模型  挑取GFP转化PAO1菌株单菌落接种LBroth培养液，37，180r/min振荡培养过夜；调整A600值至0.5；接种PAO1菌液于预先放置灭菌盖玻片(8mm×8mm，作为黏附载体)的24孔细胞培养板中，每孔1ml；37，分4个不同

14、时间段6h、1d、3d、6d孵育，隔日换液，每个时间段重复5次。    1.2  激光共聚焦显微镜观察    氩激光(488nm)激发，物镜×20，每个模型由外(BF游离的一面)向内(BF和玻片相贴的一面)逐层扫描(沿Z轴扫描)，每个标本扫描816张。    1.3  运用ISA软件对PAO1菌株BF结构定量化分析    将上述获得的各时间组模型图片堆调入ISA3D软件，确认图片的完整性及顺序后运行ISA及ISA3D命令，运行结果包括：结构参数：

15、如结构熵(textural entropy，TE)、结构能(energy，E)、均一性(homogeneity，H)；平面参数：区域孔率(areal porosity，AP)、平均扩散距离(average diffusion distance，ADD)、最大扩散距离(maximum diffusion distance，MDD)等指标；其它参数：如生物量(biovolume，BV)、比表面积(surface area between biomass and void，SA)、单位面积生物膜体积(biomass volume to surface area ratio，V2SA)等3。输出数据以

16、EXCEL格式保存。    2  结果    2.1  GFP标记的PAO1菌株构建与发光表型观察    通过电转化方法对PAO1菌株进行了pGFPuv标记。转化菌株自然光下即可见绿色荧光，在紫外灯下发出强绿色荧光；荧光显微镜下，转化菌株菌体发出明亮的绿色荧光，细菌形态呈短棒状，提示pGFPuv已经成功转入了PAO1菌株中，该转化菌株可以作为BF空间结构定量化分析研究的模式菌。    2.2  转化菌株质粒提取鉴定及双酶切鉴定    转化菌株抽提质粒后，电泳结果显示在2000和3500bp之间有一条约3300bp带，条带与质粒大小吻合。提取的质粒进行EcoRI和HindIII双酶切，电泳显示在2000和3500bp之间有一条约2500bp带，在500和1000bp之间有一条约800b