乳酸菌检验操作规范培训

1、乳酸菌检验操作规范培训乳酸菌检验操作规范培训质量管理部质量管理部目录目录一、一、乳酸菌乳酸菌二、仪器设备二、仪器设备三、三、 培养基培养基四、无菌室准备四、无菌室准备五、接种培养五、接种培养六、菌落计数六、菌落计数七、乳酸菌在改良七、乳酸菌在改良MC培养基上菌落特征培养基上菌落特征八、过氧化氢酶试验八、过氧化氢酶试验一、一、乳酸菌乳酸菌1 1、乳酸菌的概念、乳酸菌的概念乳酸菌一词并非生物分类学名词，而是指乳酸菌一词并非生物分类学名词，而是指能够利用发酵性糖类产生大量乳酸的一类能够利用发酵性糖类产生大量乳酸的一类微生物的统称。微生物的统称。通常将乳酸细菌之类群称为乳酸菌。通常将乳酸细菌之类群称为

2、乳酸菌。2 2、乳酸菌主要分布、乳酸菌主要分布乳杆菌属（乳杆菌属（LactobacillusLactobacillus） 链球菌属（链球菌属（StreptococcusStreptococcus）明串珠菌属（明串珠菌属（LeuconostocLeuconostoc）片球菌属（片球菌属（PediococcusPediococcus）双歧杆菌属（双歧杆菌属（BifidobacteriumBifidobacterium）（一）乳杆菌属（一）乳杆菌属（LactobacillusLactobacillus）1乳杆菌属的形态特征乳杆菌属的形态特征 细胞呈杆状，多为长杆状、短杆状及棒杆状，一细胞呈杆状，多为

3、长杆状、短杆状及棒杆状，一般成短链排列。革兰氏染色阳性，通常不运动，般成短链排列。革兰氏染色阳性，通常不运动，无芽孢。无芽孢。2乳杆菌属的生物学特点乳杆菌属的生物学特点 化能异养型，营养要求严格，生长繁殖需要多种化能异养型，营养要求严格，生长繁殖需要多种氨基酸、维生素、肽、核酸衍生物。氨基酸、维生素、肽、核酸衍生物。 厌氧、耐氧性厌氧或兼性厌氧厌氧、耐氧性厌氧或兼性厌氧 生长最适生长最适pH为为5.56.2，在，在pH5的环境中可生长，的环境中可生长，而中性或初始碱性条件下生长速率降低。而中性或初始碱性条件下生长速率降低。生长温度范围，生长温度范围，253，最适生长温度，最适生长温度3040。

4、 3乳杆菌属的代表种乳杆菌属的代表种 3.1保加利亚乳杆菌（保加利亚乳杆菌（L.bulgaricus）细胞形态长杆状，两端钝圆。细胞形态长杆状，两端钝圆。固体培养基生长的菌落呈棉花状，易与其它乳酸固体培养基生长的菌落呈棉花状，易与其它乳酸菌区别。菌区别。能利用葡萄糖、果糖、乳糖进行同型乳酸发酵产能利用葡萄糖、果糖、乳糖进行同型乳酸发酵产生生D型乳酸（有酸涩味，适口性差），不能利型乳酸（有酸涩味，适口性差），不能利用蔗糖。用蔗糖。该菌是乳酸菌中产酸能力最强的菌种。该菌是乳酸菌中产酸能力最强的菌种。蛋白质分解力较弱，发酵乳中可产生香味物质蛋白质分解力较弱，发酵乳中可产生香味物质乙醛。乙醛。最适生长

5、温度最适生长温度3745，温度高于，温度高于50或低于或低于20不生长。不生长。常作为发酵酸奶的生产菌。常作为发酵酸奶的生产菌。 3.2嗜酸乳杆菌（嗜酸乳杆菌（L.acidophilus） 细胞形态比保加利亚乳杆菌小，呈细长杆状，能细胞形态比保加利亚乳杆菌小，呈细长杆状，能利用葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖进行同型乳酸发利用葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖进行同型乳酸发酵产生乳酸。酵产生乳酸。最适生长温度最适生长温度37，20以下不生长，耐热性差。以下不生长，耐热性差。蛋白质分解力较弱。蛋白质分解力较弱。 最适生长最适生长pH 5.56.0，耐酸性强，能在其它乳酸，耐酸性强，能在其它乳酸菌不能生长的酸性环境

6、中生长繁殖。菌不能生长的酸性环境中生长繁殖。嗜酸乳杆菌是能够在人体肠道定殖的少数有益微嗜酸乳杆菌是能够在人体肠道定殖的少数有益微生物菌群之一，其代谢产物有机酸和抗菌物质生物菌群之一，其代谢产物有机酸和抗菌物质乳杆菌素可抑制病原菌和腐败菌的生长。乳杆菌素可抑制病原菌和腐败菌的生长。 （二）链球菌属（二）链球菌属（Streptococcus）1链球菌属的形态特征链球菌属的形态特征 细胞呈球形或卵圆形，成对或成链排列。革兰氏细胞呈球形或卵圆形，成对或成链排列。革兰氏染色阳性，无芽孢，一般不运动，不产生色素。染色阳性，无芽孢，一般不运动，不产生色素。2链球菌属的生物学特点链球菌属的生物学特点 化能异养

7、型，同型乳酸发酵产生右旋乳酸；化能异养型，同型乳酸发酵产生右旋乳酸；兼性厌氧型，接触酶反应阴性，厌氧培养兼性厌氧型，接触酶反应阴性，厌氧培养生长良好。生长良好。 3链球菌属的代表种链球菌属的代表种 嗜热链球菌（嗜热链球菌（St.thermophilus） 细胞形态呈链球状。细胞形态呈链球状。能利用葡萄糖、果糖、乳糖和蔗糖进行发酵产生乳能利用葡萄糖、果糖、乳糖和蔗糖进行发酵产生乳酸酸 。蛋白质分解力较弱，在发酵乳中可产生香味物质双蛋白质分解力较弱，在发酵乳中可产生香味物质双乙酰。乙酰。 该菌主要特征是能在高温条件下产酸，最适生长温该菌主要特征是能在高温条件下产酸，最适生长温度度4045，温度低于

8、，温度低于20不产酸。耐热性强，能不产酸。耐热性强，能耐耐6568的高温。的高温。（三）明串珠菌属（三）明串珠菌属（Leuconostoc） 菌落一般小于菌落一般小于1.0mm，光滑、圆形、灰白色，光滑、圆形、灰白色 细胞球形或豆状，成对或成链排列细胞球形或豆状，成对或成链排列 。革兰氏染色阳性，不运动，无芽孢。革兰氏染色阳性，不运动，无芽孢。（四）双歧杆菌属（四）双歧杆菌属（Bifidobacterium） 1双歧杆菌属的形态特征双歧杆菌属的形态特征 细胞呈多样形态：细胞呈多样形态：Y字型、字型、V字型、弯曲状、勺型，字型、弯曲状、勺型，典型形态为分叉杆菌典型形态为分叉杆菌 革兰氏染色阳性，

9、亚甲基兰染色菌体着色不规则。革兰氏染色阳性，亚甲基兰染色菌体着色不规则。无芽孢和鞭毛，不运动。无芽孢和鞭毛，不运动。 2双歧杆菌属的生物学特点双歧杆菌属的生物学特点 化能异养型，对营养要求苛刻，生长繁殖需要多化能异养型，对营养要求苛刻，生长繁殖需要多种双歧因子种双歧因子 。能利用葡萄糖、果糖、乳糖和半乳糖，生成乳酸能利用葡萄糖、果糖、乳糖和半乳糖，生成乳酸和乙酸及少量的甲酸和琥珀酸。和乙酸及少量的甲酸和琥珀酸。 蛋白质分解力微弱。蛋白质分解力微弱。专性厌氧，但不同菌种或菌株对氧的敏感性存在专性厌氧，但不同菌种或菌株对氧的敏感性存在差异，多次传代培养后，菌株的耐氧性增强。差异，多次传代培养后，菌

10、株的耐氧性增强。生长温度范围生长温度范围2545，最适生长温度，最适生长温度37。生长生长pH值范围值范围4.58.5，最适生长起始，最适生长起始pH值值6.57.0，不耐酸，酸性环境（，不耐酸，酸性环境（pH5.5）对菌体存活不）对菌体存活不利。利。 3、代表种、代表种 人体肠道中共有人体肠道中共有8种，其中数量最多的种，其中数量最多的5种为：种为：两歧双歧杆菌（两歧双歧杆菌（B.bifidum）婴儿双歧杆菌（婴儿双歧杆菌（B.infantis）青春双歧杆菌（青春双歧杆菌（B.adolescentis）长双歧杆菌（长双歧杆菌（B.longum）短双歧杆菌短双歧杆菌(B.breve)4、双歧杆

11、菌功能、双歧杆菌功能是人体肠道有益菌群，它可定殖在宿主的肠粘膜是人体肠道有益菌群，它可定殖在宿主的肠粘膜上形成生物学屏障上形成生物学屏障 具有拮抗致病菌、改善微生态平衡、合成多种微具有拮抗致病菌、改善微生态平衡、合成多种微生素、提供营养、抗肿瘤、降低内毒素、提高免生素、提供营养、抗肿瘤、降低内毒素、提高免疫力、保护造血器官、降低胆固醇水平等重要生疫力、保护造血器官、降低胆固醇水平等重要生理功能，其促进人体健康的有益作用，远远超过理功能，其促进人体健康的有益作用，远远超过其它乳酸菌。其它乳酸菌。 二、检测仪器设备二、检测仪器设备 冰箱：冰箱：04恒温培养箱：恒温培养箱：361恒温水浴锅：恒温水浴

12、锅：461微生物显微镜微生物显微镜架盘药物天平：架盘药物天平：0g500g，精确至，精确至0.5g三角瓶：三角瓶：500ml灭菌刻度吸管：灭菌刻度吸管：1ml、10ml 灭菌平皿：直径灭菌平皿：直径90mm三、三、 培养基培养基 1、改良、改良MC培养基培养基 成分：大豆蛋白胨，成分：大豆蛋白胨，5g；牛肉浸膏，；牛肉浸膏，5g;酵母酵母浸膏，浸膏，5g；葡萄糖，；葡萄糖，20g；乳糖，；乳糖， 20g；碳酸；碳酸钙，钙， 10g；琼脂，；琼脂，15g；蒸馏水，；蒸馏水，1000mL；1的中性红溶液，的中性红溶液，5mL；硫酸多粘菌素；硫酸多粘菌素B，10万万IU。 11515分钟高压灭菌备用

13、。分钟高压灭菌备用。2、培养基的准备、培养基的准备使用前，将灭菌培养基用微波炉或水浴锅使用前，将灭菌培养基用微波炉或水浴锅加热溶解，在加热溶解，在4045水浴中保温待用。水浴中保温待用。四、无菌室准备四、无菌室准备无菌室使用前后，用紫外灯照射无菌室使用前后，用紫外灯照射3040min。将。将工作服、工作帽和工作鞋放入无菌室进行灭菌，工作服、工作帽和工作鞋放入无菌室进行灭菌，进入无菌室前换上工作服、工作帽和工作鞋。进入无菌室前换上工作服、工作帽和工作鞋。超净工作台面，使用前用超净工作台面，使用前用75%酒精擦拭消毒后，酒精擦拭消毒后，用紫外灯照射用紫外灯照射4045min；操作结束后，用洁净；操

14、作结束后，用洁净抹布将操作台面擦拭干净后，用抹布将操作台面擦拭干净后，用75%的酒精棉球的酒精棉球进行擦拭，开启紫外灯照射进行擦拭，开启紫外灯照射4045min。五、接种培养五、接种培养 以无菌操作，用以无菌操作，用1ml灭菌刻度吸管吸取灭菌刻度吸管吸取1ml样品原液，注入含有灭菌生理盐水的试管样品原液，注入含有灭菌生理盐水的试管内，充分振摇，制成内，充分振摇，制成1:10的稀释液。的稀释液。注意：刻度吸管尖端不要触及试管内生理注意：刻度吸管尖端不要触及试管内生理盐水。盐水。用用1ml灭菌刻度吸管吸取灭菌刻度吸管吸取1ml1:10的稀释液，注的稀释液，注入含有灭菌生理盐水的试管内，振摇试管，混

15、入含有灭菌生理盐水的试管内，振摇试管，混合均匀。合均匀。注意：吸取稀释液前，用刻度吸管吹打，使稀注意：吸取稀释液前，用刻度吸管吹打，使稀 释混合均匀。刻度吸管尖端不要触及管内稀释释混合均匀。刻度吸管尖端不要触及管内稀释液。液。另取另取1ml灭菌刻度吸管，按上述操作顺序，灭菌刻度吸管，按上述操作顺序，做做10倍递增稀释液，如此每递增一次，即倍递增稀释液，如此每递增一次，即换用换用1支支1ml灭菌刻度吸管。灭菌刻度吸管。在无菌操作条件下，用在无菌操作条件下，用1ml灭菌刻度吸管吸灭菌刻度吸管吸取选定的样品稀释液或原液至灭菌平皿内。取选定的样品稀释液或原液至灭菌平皿内。 同上对同一样品重复操作，即每

16、个选定的适同上对同一样品重复操作，即每个选定的适当的样品稀释液做两个平皿。当的样品稀释液做两个平皿。 按以上步骤，以按以上步骤，以1ml灭菌生理盐水作为空白操灭菌生理盐水作为空白操作对照。作对照。 在无菌操作条件下，将约在无菌操作条件下，将约15ml的改良的改良MC培培养基倾入样品平皿中，将平皿置于操作台面养基倾入样品平皿中，将平皿置于操作台面上轻轻转动，使样品和培养基混合均匀。上轻轻转动，使样品和培养基混合均匀。 接种培养操作录像接种培养操作录像检测检测乳酸菌检测乳酸菌检测.MPG讨论讨论录像中存在细节问题：录像中存在细节问题：1、拿平板前先消毒手、拿平板前先消毒手2、倒培养基前要对培养基的

17、瓶进行消毒，、倒培养基前要对培养基的瓶进行消毒，可以酒精棉球消毒和酒精灯外焰消毒。可以酒精棉球消毒和酒精灯外焰消毒。待培养基凝固后，将平皿翻转，即有培养待培养基凝固后，将平皿翻转，即有培养基的一面向上。基的一面向上。 将所有平皿置于将所有平皿置于361培养箱中，培养培养箱中，培养723h，观察乳酸菌菌落特征。，观察乳酸菌菌落特征。 六、菌落计数六、菌落计数 选取菌落数在选取菌落数在30300之间的平皿进行计数。之间的平皿进行计数。 计数后，随机挑取五个菌落进行革兰氏染色，显计数后，随机挑取五个菌落进行革兰氏染色，显微镜检查并做过氧化氢酶试验。微镜检查并做过氧化氢酶试验。 革兰氏阳性，过氧化氢酶

18、阴性，无芽孢的球菌或革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，无芽孢的球菌或杆菌可定为乳酸菌。杆菌可定为乳酸菌。根据证实为乳酸菌菌落计算出该皿内的乳酸菌数，根据证实为乳酸菌菌落计算出该皿内的乳酸菌数，乘以其稀释倍数即得每毫升样品中乳酸菌数。乘以其稀释倍数即得每毫升样品中乳酸菌数。例如检样例如检样10-4的稀释液在改良的稀释液在改良MC平板上，生成可平板上，生成可疑菌落为疑菌落为35个，取五个鉴定，证实为乳酸菌的是四个，取五个鉴定，证实为乳酸菌的是四个，则个，则1ml样品中乳酸菌数为：样品中乳酸菌数为：35*4/5*104=2.8*105。 七、乳酸菌在改良七、乳酸菌在改良MC培养基上菌落特征培养基上菌落特征菌体菌体改改 良良 MC杆菌杆菌平皿底为粉红色，菌落较小，圆形、红色、边平皿底为粉红色，菌落较小，圆形、红色、边缘似星状，