目的基因的克隆与基因文库的构建精美生物医学

1、会计学1目的基因的克隆与基因文库的构建精美目的基因的克隆与基因文库的构建精美生物医学生物医学提取某生物提取某生物全部全部DNA用适当用适当限制酶切割限制酶切割许许 多多DNA片段片段与载体连接与载体连接导入受体菌群导入受体菌群该生物基该生物基因组文库因组文库（每个受体菌含有一段不同的（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）片段）mRNA逆转录酶逆转录酶杂交双链杂交双链核酸酶核酸酶H单链单链DNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNA与载体连接与载体连接导入受体菌群导入受体菌群该生物该生物cDNA文库文库5、基因文库的质量标准 尽可能高的完备性重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好

2、大于基因的长度 避免基因被分隔克隆克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序克隆片段易于从载体分子上完整卸下重组克隆能稳定保存、扩增、筛选二、二、目的基因的克隆用限制酶切断成许用限制酶切断成许多片段多片段1 1、直接分离法、直接分离法“鸟枪法鸟枪法”鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大，需要了解目的基因的背景知识不能获得的最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构2 2、人工合成基因法：、人工合成基因法：1 1）逆转录法：）逆转录法：mRNAmRNA双链双链DNADNA( (即目的基因即目的基因) )逆转录酶逆转录酶单链单链DNADNA合成合成2 2）直接合成法：）直接

3、合成法：蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因（双链）目的基因（双链）化学合成化学合成DNA合成仪合成仪推推测测推推测测合合成成4 4、利用、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段5 5/ /3 3/ /G GG GT TC C3 3/ /5 5/ /G GA AC CC C5 5/ /3 3/ /引物引物G GG G1.目的基因受热变性，解旋；目的

4、基因受热变性，解旋；2.引物与单链互补结合；引物与单链互补结合；3.合成链在合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸。聚合酶作用下进行延伸。5 5/ /3 3/ /A AG G引物引物(2)(2)利用利用扩增扩增原理：原理：_DNADNA复制复制条件：条件：_、 _、_ _ 、 _ (_ (做启动子做启动子) )。已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物DNADNA聚合酶、解旋酶聚合酶、解旋酶方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循为扩增循 环的次数）环的次数）指数指数2 2n n结果：结果：使目的基因的片段在使目的基因的片段在短时间内

5、成百万倍地扩增短时间内成百万倍地扩增过程：过程：a a、DNADNA变性变性（90-9690-96）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火、退火（复性复性25-6525-65）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物物与与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。 c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从 引物的引物的55端端33端端延伸，合成与模板互补延伸，合成与模板互补 的的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链三、基因文库的构建（一）切割：基因组D

6、NA的分解 用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法。超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头 部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如：Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控 连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！ 上述几种上述几种载体的最大装载量如下：载体的最大装载量如下：质粒l l-DNA考斯质粒15 kb25 kb45 kbYAC400 kb密集铺板（1-10万）杂交挖取铺板铺板目的重组克隆二、筛选：从基因文库中筛选目的基因基因文库序列测定的技

7、术序列测定的技术 杂交测序法杂交测序法 质谱法质谱法 单分子测序法单分子测序法 原子探针显微镜测序法原子探针显微镜测序法DNA 芯片法芯片法 经典方法经典方法:Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法(Sanger,1977)Maxam-Gilbert DNA化学降解法化学降解法(Maxam &Gilbert,1977)新技术方法新技术方法:Sanger双脱氧终止法双脱氧终止法*少一个少一个OH脱氧核甘酸脱氧核甘酸与与双脱氧核甘酸双脱氧核甘酸结构比较结构比较荧光检测探头荧光检测探头电泳，看谁跑得快5、基因文库的质量标准 尽可能高的完备性重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力载体的

8、装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序克隆片段易于从载体分子上完整卸下重组克隆能稳定保存、扩增、筛选鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大，需要了解目的基因的背景知识不能获得的最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构2 2、人工合成基因法：、人工合成基因法：1 1）逆转录法：）逆转录法：mRNAmRNA双链双链DNADNA( (即目的基因即目的基因) )逆转录酶逆转录酶单链单链DNADNA合成合成2 2）直接合成法：）直接合成法：蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因（双链）目的基因（双链）化学合成化学合成三、基因文库的构建（一）切割：基因组DNA的分解 用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法。