第三节动物细胞培养

1、 皮肤烧伤，如果创面很小（不大于硬币）只要保持清洁，甚至深度烧伤，也可能自愈。如果下层真皮受损面积较大，常常需要植皮。植皮需要的健康皮片。植皮需要的健康皮片，可以取自烧伤病人自身未烧伤的部位（自体植皮），也可取自其他活人或尸体（异体植皮）等。自体植皮是永久性的，取自其他人或动物的植皮是暂时性的，是在创面愈合过程中为保护创面而采取的措施，1014天后就要被身体排斥。 如果一个大面积烧伤的病人来说，自体皮肤有限，其他渠道的皮肤来源不足。如何才能获得大量的自体健康皮肤？动物细胞工程离体植物器官、离体植物器官、组织或细胞组织或细胞植物细胞工程常用的技术植物细胞工程常用的技术:植物组织培养、植物细胞培养

2、植物组织培养、植物细胞培养 、植物体细胞杂交、植物体细胞杂交温故而知新温故而知新悬浮细胞悬浮细胞植物体植物体愈伤组织愈伤组织胚状体胚状体脱（去）分化脱（去）分化再分化再分化（芽、根）（芽、根）细胞群体细胞群体细胞次生细胞次生代谢产物代谢产物植物体细胞杂交植物体细胞杂交植物细胞植物细胞a 植物细胞植物细胞b 去细胞壁去细胞壁原生质体融合原生质体融合杂种细胞杂种细胞愈伤组织愈伤组织杂种植株杂种植株植物组织培养植物组织培养植物细胞融合这个过程中涉及的原理是？这个过程中涉及的原理是？细胞膜的流动性细胞膜的流动性 植物细胞的全能性植物细胞的全能性动物细胞工程动物细胞工程常用技术常用技术 动物细胞培养动物

3、细胞培养 动物组织培养动物组织培养 细胞核移植细胞核移植 体细胞克隆体细胞克隆 动物细胞融合动物细胞融合 单克隆抗体单克隆抗体 动物细胞培养技术动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技是其他动物细胞工程技术的术的基础基础。一、动物细胞与组织培养一、动物细胞与组织培养1、概念：、概念： 是指在是指在体外体外模拟动物体内环境，将动物模拟动物体内环境，将动物的细胞或组织在的细胞或组织在无菌无菌、温度适宜温度适宜和和营养充足营养充足的条件下培养，使其继的条件下培养，使其继续生长、增殖并维持续生长、增殖并维持原有的结构和功能原有的结构和功能的技术。目的是获得细胞的技术。目的是获得细胞或细胞代谢产物。或细胞代

4、谢产物。 2、选料：、选料： 动物胚胎或幼龄动物的组织、器官，动物胚胎或幼龄动物的组织、器官，因为这因为这些细胞生命力旺盛，分裂能力强。些细胞生命力旺盛，分裂能力强。动物细胞培养过程：动物细胞培养过程：动物胚胎或幼龄动动物胚胎或幼龄动物的组织、器官物的组织、器官细胞悬浮液细胞悬浮液10代细胞代细胞50代细胞代细胞无限传代无限传代单个细胞单个细胞加培养液加培养液剪碎剪碎胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶或胶原蛋白酶胰蛋白酶或胶原蛋白酶4、有关概念、有关概念 原代培养：原代培养：是指从供体获取组织或细胞后的是指从供体获取组织或细胞后的初次培养。初次培养。 传代培养：传代培养：将原代培养的细胞分离稀释后转将原

5、代培养的细胞分离稀释后转入新的培养瓶中，继续培养，称为传代培养。入新的培养瓶中，继续培养，称为传代培养。 细胞株：细胞株：原代培养的细胞一般传至原代培养的细胞一般传至10代左代左右，细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少右，细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到数细胞存活到4050代，这种传代细胞为细胞代，这种传代细胞为细胞株。株。 细胞系：细胞系：细胞株传代至细胞株传代至50代后又出现细胞代后又出现细胞生长停滞状态只有部分细胞由于遗传物质的改生长停滞状态只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。传代细

6、胞为细胞系。细胞株和细胞系的区别细胞株和细胞系的区别： 细胞系的遗传物质细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。易传代培养。 贴壁生长：贴壁生长：动物细胞在液体培养基中生长动物细胞在液体培养基中生长一段时间之后，大部分细胞会贴附在培养瓶的一段时间之后，大部分细胞会贴附在培养瓶的表面生长。表面生长。 接触抑制接触抑制: :细胞在培养瓶中贴壁生长，随细胞在培养瓶中贴壁生长，随着细胞越来越多，当贴壁生长的细胞分裂生长着细胞越来越多，当贴壁生长的细胞分裂生长到表面相互接触时，就停止分裂增殖，这种现到表面相互接触时，就停止分裂增殖，这种

7、现象叫做接触抑制。象叫做接触抑制。动物细胞培养过程：动物细胞培养过程：动物胚胎或幼龄动动物胚胎或幼龄动物的组织、器官物的组织、器官细胞悬浮液细胞悬浮液胰蛋白酶或胶原蛋白酶胰蛋白酶或胶原蛋白酶10代细胞代细胞原代培养原代培养50代细胞代细胞细胞株细胞株无限传代无限传代细胞系细胞系传代培养传代培养单个细胞单个细胞加培养液加培养液遗传物质未遗传物质未改变改变遗传物质遗传物质改变改变剪碎剪碎胰蛋白酶胰蛋白酶5 5、动物细胞培养条件：、动物细胞培养条件：1、无菌、无毒的环境、无菌、无毒的环境 （添加一定量的抗生素，定期更换培养液）（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）2、营养、营养（葡萄糖、氨基酸、无机

8、盐、维生素、葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清动物血清等。等。）3、温度和、温度和ph温度温度37左右左右 ph 7.2-7.44、气体环境：、气体环境： o2和和co2（95%空气和空气和5% co2 ）保证细胞顺利的保证细胞顺利的生长增殖生长增殖问题：问题：1.为何要定期用胰蛋白酶使细胞从瓶壁为何要定期用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上脱离下来？上脱离下来？2.比较动物细胞培养和植物组织培养所比较动物细胞培养和植物组织培养所用的培养基的成分用的培养基的成分.3.动物细胞培养是否能像植物细胞一样动物细胞培养是否能像植物细胞一样 最终培养成新个体？最终培养成新个体？获得细胞获得细胞细胞的全能性细胞

9、的全能性细胞株、细胞系细胞株、细胞系植物体植物体培养结果培养结果或细胞分泌蛋白或细胞分泌蛋白快速繁殖、培育快速繁殖、培育无病毒植株等无病毒植株等培养目的培养目的葡萄糖、动物血清葡萄糖、动物血清蔗糖、植物激素蔗糖、植物激素培养基特有成分培养基特有成分液体培养基固体培养基固体培养基培养基性质培养基性质细胞增殖原理原理动物细胞培养动物细胞培养植物组织培养植物组织培养比较项目比较项目2 2、植物组织培养和动物细胞培养的比较、植物组织培养和动物细胞培养的比较6 6、动物细胞培养技术的应用、动物细胞培养技术的应用1、获得细胞产物，如蛋白质生物、获得细胞产物，如蛋白质生物 制品病毒疫苗、干扰素、单克制品病毒

10、疫苗、干扰素、单克隆抗体等隆抗体等2、器官移植的培养、器官移植的培养3、获得细胞用于检测有毒物质、获得细胞用于检测有毒物质 1 1、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞（）、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞（） a a细胞系细胞系 b b细胞株细胞株 c c原代细胞原代细胞 d d传代细胞传代细胞 2 2、动物细胞工程技术的基础是、动物细胞工程技术的基础是 - - （ ） a.a.动物细胞融合动物细胞融合 b.b.单克隆抗体单克隆抗体 c.c.胚胎移植胚胎移植 d.d.动物细胞培养动物细胞培养ad 3 3、为了使用于培养的动物组织细胞分散开以便配制成一定浓度为了使用于培养的动物

11、组织细胞分散开以便配制成一定浓度的细胞悬浮液，选取来的动物组织应选用下列哪种物质处理（的细胞悬浮液，选取来的动物组织应选用下列哪种物质处理（ ）a.a.胃蛋白酶胃蛋白酶 b. b.胰蛋白酶胰蛋白酶 c. c.盐酸盐酸 d. d.胰脂肪酶胰脂肪酶教学反馈教学反馈b4 4、用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的、用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞 （ ）a.a.容易产生各种变异容易产生各种变异 b b具有更强的全能性具有更强的全能性c.c.取材十分方便取材十分方便 d d

12、分裂增殖的能力强分裂增殖的能力强d5、在动物细胞培养的有关叙述中，正确的是（、在动物细胞培养的有关叙述中，正确的是（ ） a动物细胞培养的目的就是为了获得大量的细胞分动物细胞培养的目的就是为了获得大量的细胞分泌蛋白泌蛋白 b动物细胞培养前要用胰蛋白酶处理使细胞分散动物细胞培养前要用胰蛋白酶处理使细胞分散 c细胞遗传物质的改变发生于原代培养过程中细胞遗传物质的改变发生于原代培养过程中 d培养至培养至50代后继续传代的细胞是细胞株代后继续传代的细胞是细胞株6、在动物细胞培养中有部分细胞可能在培养条件下无、在动物细胞培养中有部分细胞可能在培养条件下无限制地传代下去，这种传代细胞称之为（限制地传代下去

13、，这种传代细胞称之为（ ） a原代培养原代培养 b传代培养传代培养 c细胞株细胞株 d细胞系细胞系bd7、下列与动物细胞培养有关的表述中，不正确的是（下列与动物细胞培养有关的表述中，不正确的是（ ）a培养液通常含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和培养液通常含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清动物血清b原代培养的细胞一般传至原代培养的细胞一般传至10代左右便会出现生长停滞代左右便会出现生长停滞c动物细胞培养一般能够传到动物细胞培养一般能够传到4050代，但其遗传物代，但其遗传物质发生了改变质发生了改变d动物细胞培养可用于检测有毒物质和获得大量自身健动物细胞培养可用于检测有毒物质和获得大量

14、自身健康细胞c8 8、下图是动物细胞培养的基本过程示意图。请据此图回答、下图是动物细胞培养的基本过程示意图。请据此图回答 (1)(1)容器容器a a中放置的是动物器官或组织。它一般取中放置的是动物器官或组织。它一般取自自_。(2)(2)容器容器a a中的动物器官或组织首先要进行的处理中的动物器官或组织首先要进行的处理是是_，然后用，然后用 酶处理，这是为了酶处理，这是为了使细胞分散开来。这样做的目的是使细胞分散开来。这样做的目的是_._. (3) (3)培养首先在培养首先在b b瓶中进行。瓶中的培养基成分有瓶中进行。瓶中的培养基成分有_ _等。在此瓶中培等。在此瓶中培养一段时间后，一般传到第养

15、一段时间后，一般传到第 代，有许多细代，有许多细胞衰老死亡，到这时的培养称为胞衰老死亡，到这时的培养称为_._.(4)(4)为了把为了把b b瓶中的细胞分装到瓶中的细胞分装到c c瓶中，用瓶中，用_处理，然后配置成处理，然后配置成_，再分装。，再分装。(5)(5)在在c c瓶中正常培养了一段时间后，发现细胞全瓶中正常培养了一段时间后，发现细胞全部死亡。原因是部死亡。原因是_。幼龄动物的器官或组织、动物胚胎幼龄动物的器官或组织、动物胚胎剪碎剪碎 胰蛋白胰蛋白 使每个细胞能与培养液接触使每个细胞能与培养液接触 葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清 10原

16、代培养原代培养胰蛋白酶胰蛋白酶 细胞悬浮液细胞悬浮液细胞没有发生癌变细胞没有发生癌变二二 动物细胞核移植和动物体细胞克隆动物细胞核移植和动物体细胞克隆1 1 概念概念将某种动物细胞的将某种动物细胞的细胞核细胞核移入同种或者异种动物的移入同种或者异种动物的去除细胞核的成熟卵细胞内去除细胞核的成熟卵细胞内的技术。的技术。动物体细胞克隆动物体细胞克隆是将供体细胞的是将供体细胞的细胞核细胞核与与受体去核卵细胞受体去核卵细胞的细胞质的细胞质进行人工组合，借助卵细胞的发育能力，经过培养进行人工组合，借助卵细胞的发育能力，经过培养发育成发育成胚胎胚胎进而形成进而形成个体个体的技术。其中的关键技术的技术。其中

17、的关键技术是是细胞核移植技术细胞核移植技术。用核移植的方法得到的动物用核移植的方法得到的动物称为克隆动物称为克隆动物动物细胞核移植动物细胞核移植多利羊的产生过程：多利羊的产生过程：黑面绵羊去黑面绵羊去核卵细胞核卵细胞白面绵羊乳白面绵羊乳腺细胞核腺细胞核细胞核移植细胞核移植重组细胞重组细胞早期胚胎早期胚胎胚胎移植胚胎移植另一头绵羊的子宫另一头绵羊的子宫妊娠、出生妊娠、出生克隆羊多利克隆羊多利2 2 过程过程供体动物的组织供体动物的组织细胞培育细胞培育供体细胞核供体细胞核卵细胞卵细胞去核去核去核卵细胞去核卵细胞注入注入重组细胞重组细胞分裂分裂重组胚胎重组胚胎胚胎移植胚胎移植代孕母牛代孕母牛新个体新

18、个体 用卵细胞的原因？用卵细胞的原因？细胞已经发育成熟细胞已经发育成熟; ;细胞核较易取出；有重组和发细胞核较易取出；有重组和发育所需的因子便于发育成胚胎育所需的因子便于发育成胚胎受体卵母细胞为什么要先去核？受体卵母细胞为什么要先去核？为了使克隆动物的遗传物质为了使克隆动物的遗传物质( (核内核内) )全部来自供体全部来自供体动物的细胞；保证获得其遗传特性。动物的细胞；保证获得其遗传特性。克隆是克隆是100%100%的复制吗？的复制吗？不是，克隆动物的核内不是，克隆动物的核内dnadna跟供体动物的体细胞一跟供体动物的体细胞一样，但其细胞质的样，但其细胞质的dnadna则来源于受体卵母细胞。此

19、则来源于受体卵母细胞。此外，动物的行为，习性受还环境的影响，可能与外，动物的行为，习性受还环境的影响，可能与供体动物不同。供体动物不同。二二 动物细胞核移植和克隆动物动物细胞核移植和克隆动物1 1、 应用前景应用前景保护濒危物种增加动物保护濒危物种增加动物 的存活数量的存活数量用于组织器官的移植，用于组织器官的移植，皮肤移植皮肤移植2 2 存在的问题存在的问题成功率不高成功率不高克隆动物存在健康、生理缺陷、遗传缺陷等克隆动物存在健康、生理缺陷、遗传缺陷等三三 动物细胞融合动物细胞融合1 1 概念概念指在一定条件下指在一定条件下2 2个或多个动物细胞融合形成一个个或多个动物细胞融合形成一个细胞的

20、过程细胞的过程融合融合后形成的具有原来两个或多个细胞的遗传信后形成的具有原来两个或多个细胞的遗传信息的细胞为息的细胞为杂交细胞杂交细胞。2 2 过程过程不同的两个细胞不同的两个细胞灭活病毒灭活病毒或或peg杂交细胞杂交细胞3 3 意义意义克服远缘杂交的不亲和性克服远缘杂交的不亲和性诱导动物细胞融合的方诱导动物细胞融合的方法法动物细胞融合的用途：动物细胞融合的用途：制备单克隆抗体制备单克隆抗体：仙台病毒：仙台病毒紫外线紫外线丧失感染活性丧失感染活性（不感染细胞）（不感染细胞）保留融合活性保留融合活性（诱导细胞融合（诱导细胞融合）物理法物理法 化学法化学法（peg）生物法生物法四四 单克隆抗体单克

21、隆抗体 抗体：抗体：由效应由效应b b淋巴细胞产生的，主要成淋巴细胞产生的，主要成分是球蛋白，一种效应分是球蛋白，一种效应b b淋巴细胞淋巴细胞只分泌一种特异性抗体只分泌一种特异性抗体单克隆抗体概念的理解：单克隆抗体概念的理解：单克隆抗体：由这些细胞群产生的化学性质单单克隆抗体：由这些细胞群产生的化学性质单 一、特异性强的抗体一、特异性强的抗体单克隆单克隆: :由单个效应由单个效应b b细胞通过无性繁殖获得细胞群细胞通过无性繁殖获得细胞群 原始的方法原始的方法：获得抗体，特异性差，纯度低。获得抗体，特异性差，纯度低。想获得单一抗体：想获得单一抗体：必须用单个必须用单个b b淋巴细胞进行无性繁淋

22、巴细胞进行无性繁殖，通过克隆形成细胞群。殖，通过克隆形成细胞群。问题：问题：怎样才能获得单克隆抗体？怎样才能获得单克隆抗体？我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？有什么方法能使有什么方法能使b b细胞产生抗体的能力和肿瘤细胞无细胞产生抗体的能力和肿瘤细胞无限增殖能力同时具备呢？限增殖能力同时具备呢？体外培养的条件下，一个体外培养的条件下，一个b b淋巴细胞是不可能淋巴细胞是不可能无限增值的，如何使单个淋巴细胞增殖呢？无限增值的，如何使单个淋巴细胞增殖呢？设计方案：设计方案： 一个一个b b淋巴细胞只分泌一种特异性抗体淋巴细胞只分泌一种特异性抗体小鼠骨髓瘤细胞能

23、无限增殖小鼠骨髓瘤细胞能无限增殖杂种细胞杂种细胞目的目的:制备单克隆抗体制备单克隆抗体.原理：原理：b淋巴细胞能产生抗体，骨髓瘤细胞能无淋巴细胞能产生抗体，骨髓瘤细胞能无限增殖，杂交瘤细胞既能产生抗体又能无限增殖，杂交瘤细胞既能产生抗体又能无限增殖。限增殖。单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程 注射注射 抗原抗原效应效应b淋巴淋巴细胞细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞诱导细胞融合、筛选诱导细胞融合、筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞细胞培养细胞培养筛选，继续培养筛选，继续培养足够数量的、能产生足够数量的、能产生特定抗体的细胞群特定抗体的细胞群体外培养体外培养注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔单克隆抗体单克隆抗体诱导其融

24、合的方诱导其融合的方法有哪些？法有哪些？ ？ ？ 抗原抗原 效应效应b细胞细胞筛选 筛选 aa型、型、bb型型ab型杂交瘤细胞型杂交瘤细胞能产生所需抗体的细胞能产生所需抗体的细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞（1 1）为什么用小鼠骨髓瘤细胞与）为什么用小鼠骨髓瘤细胞与b b淋巴细胞融合？淋巴细胞融合？融合形成杂交瘤细胞的特点？融合形成杂交瘤细胞的特点？思考思考：（2 2）单克隆抗体制备过程中应用哪些细胞工程技）单克隆抗体制备过程中应用哪些细胞工程技 术手段？术手段？（3 3）制备过程为何要经过两次筛选？）制备过程为何要经过两次筛选？细胞膜的流动性；细胞膜的流动性；杂交瘤细胞既能大量繁殖，又可以产生单一抗

25、体杂交瘤细胞既能大量繁殖，又可以产生单一抗体动物细胞融合、动物细胞培养技术动物细胞融合、动物细胞培养技术第一次筛选出杂交瘤细胞；第一次筛选出杂交瘤细胞；第二次筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞第二次筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞（4）为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与）为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与b细胞融合？细胞融合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有遗传物质，不仅具有b细胞分泌抗体的能力，而细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体克隆抗体单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用

26、与常规抗体相比，单克隆抗体与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，产量高，特异性强，灵敏度高灵敏度高，优越性十分明显，优越性十分明显。1、作为诊断试剂、作为诊断试剂2、用于治疗疾病和运载药物、用于治疗疾病和运载药物 作为载体，运载抗癌药物，形成作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹生物导弹”治治疗肿瘤疗肿瘤主要用于制备主要用于制备单克隆抗体单克隆抗体获得杂种植株获得杂种植株用用 途途物理、化学方法物理、化学方法（同左）（同左）灭活的病毒灭活的病毒物理（离心、振物理（离心、振荡、电刺激）荡、电刺激）化学（聚乙二醇）化学（聚乙二醇）诱导方法诱导方法使细胞分散后诱使细胞分散后诱导细胞融合导细胞融

27、合去除细胞壁后诱去除细胞壁后诱导原生质体融合导原生质体融合细胞融合的方法细胞融合的方法细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性、细胞膜的流动性、植物细胞全能性植物细胞全能性细胞融合的原理细胞融合的原理动物细胞融合动物细胞融合植物体细胞杂交植物体细胞杂交比较项目比较项目比较项目比较项目植物、动物细胞融合的比较植物、动物细胞融合的比较 下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的抗下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的抗体实验方案体实验方案3 3、图中、图中b b为为_过程，常用过程，常用_作为诱导剂，该细胞继承作为诱导剂，该细胞继承_的遗传特性，既能的遗传特性，既

28、能_,_,又能又能_。1 1、该实验方案的目的是、该实验方案的目的是_2 2、a a是从小鼠的脾脏中取得是从小鼠的脾脏中取得_,_,该细胞能够产生该细胞能够产生_制备单克隆抗体制备单克隆抗体b淋巴细胞淋巴细胞抗体抗体细胞融合细胞融合灭活病毒灭活病毒双亲细胞双亲细胞分泌抗体分泌抗体无限增殖无限增殖b体外培养体外培养骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞群足够数量的细胞群注射到注射到小鼠腹腔小鼠腹腔ac 1 1、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞是变的细胞是 -（ ） a a细胞系细胞系 b b细胞株细胞株 c c原代细胞原代细胞 d d传代细胞传代细胞2 2、动物细胞工程技术的基础是、动物细胞工程技术的基础是 -（）（） a.a.动物细胞融合动物细胞融合 b.b.单克隆抗体单克隆抗体 c.