实验6——可溶性蛋白质的测定ppt课件

1、实验六：可溶性蛋白质的测定实验六：可溶性蛋白质的测定考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-2501实验原理实验原理 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。该染料在游离测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。该染料在游离形状下呈，最大光吸收在形状下呈，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色色素络合物在素络合物在595nm波长下有最大光吸收。其吸光值与蛋白质含量成正比，故可波长下有最大光吸收。其吸光值与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。用于蛋白质的定量测定。12. 适用范围与特点适用范围与特点 该法是该法是1976年年

2、Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反响非常灵建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反响非常灵敏，灵敏度比敏，灵敏度比Lowry法劳里法还高法劳里法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为白质浓度范围为01000g/mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。 该法的缺乏是当蛋白质含量过高时，线性关系较差，反复性也较差，同时该法的缺乏是当蛋白质含量过高时，线性关系较差，反复性也较差，同时染料很容易结合到比色皿上，给实验结果呵斥一定误差。染料很容易结合到比色皿上，给实验结果呵斥一定误差。23. 实验资料

3、、仪器与试剂实验资料、仪器与试剂资料：豆芽资料：豆芽仪器：可见分光光度计，分析天平，容量瓶，移液管，具塞刻度试管，研钵，仪器：可见分光光度计，分析天平，容量瓶，移液管，具塞刻度试管，研钵，漏斗，铁架台，玻璃棒。漏斗，铁架台，玻璃棒。试剂：考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G-250，无水乙醇，磷酸，牛血清蛋白。，无水乙醇，磷酸，牛血清蛋白。3试剂配制：试剂配制：考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250试剂：称取试剂：称取0.1000g考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250，溶于，溶于50mL95%乙醇中乙醇中，参与，参与85%磷酸磷酸100mL，用蒸馏水定容至，用蒸馏水定容至1000mL。规范蛋白质溶液规范蛋白质溶液1

4、00g/mL：称取：称取0.0100g牛血清蛋白牛血清蛋白BSA，溶于，溶于100mL蒸馏水中。蒸馏水中。44. 实验步骤实验步骤1样品处置：样品处置： 准确称取准确称取5g豆芽于研钵中，充分研磨后转移至豆芽于研钵中，充分研磨后转移至100mL容量瓶中，静置容量瓶中，静置20min后过滤，弃去初滤液后备用。后过滤，弃去初滤液后备用。52规范曲线的绘制规范曲线的绘制 123456BSA（mL）00.20.40.60.81水（水（mL）10.80.60.40.20蛋白质含量（蛋白质含量（g）0204060801006 取取6支支10mL具塞试管，按上表参与试剂，混合均匀后，向各管中参与具塞试管，按

5、上表参与试剂，混合均匀后，向各管中参与5mL考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250溶液，稀释至刻线溶液，稀释至刻线10mL那么蛋白质浓度分别为那么蛋白质浓度分别为0、2、4、6、8、10g/mL ，摇匀，放置，摇匀，放置5min后于后于595nm波长下比色。以蛋白质浓度波长下比色。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制规范曲线。为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制规范曲线。73样品的测定样品的测定 另取另取3支支10mL具塞试管，分别汲取样品溶液具塞试管，分别汲取样品溶液0.6mL，各参与，各参与5mL考马斯考马斯亮蓝亮蓝G-250溶液，稀释至刻线溶液，稀释至刻线10mL，充分混合，放置，充分混合，放置

6、5min后于后于595nm波长波长下比色，测定吸光度，并经过规范曲线查得蛋白质含量。下比色，测定吸光度，并经过规范曲线查得蛋白质含量。85. 结果计算结果计算 蛋白质含量蛋白质含量%=CV2V0 mV1 100式中：式中： C从规范曲线上查得的蛋白质浓度，从规范曲线上查得的蛋白质浓度，g/mL V0样品溶液的总体积，样品溶液的总体积，mL V1测定时加样量，测定时加样量，mL V2测定时定容体积，测定时定容体积，mL m 样品的质量，样品的质量，g96. 本卷须知本卷须知 1考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质经过范德华力结合，反响快速，并且稳定，考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质经过范德华力结合，反响快速，并且稳

7、定，无法用普通试剂洗掉。待一两周左右，皮屑细胞自然衰老零落即可无碍。无法用普通试剂洗掉。待一两周左右，皮屑细胞自然衰老零落即可无碍。10 2考马斯亮蓝有考马斯亮蓝有G-250和和R-250两种。两种。 蛋白质与考马斯亮蓝蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在结合在2min左右的时间内到达平衡，完成反响左右的时间内到达平衡，完成反响非常迅速，其结合物在室温下非常迅速，其结合物在室温下1h内坚持稳定。内坚持稳定。 考马斯亮蓝考马斯亮蓝R-250与蛋白质反响虽然比较缓慢，但可以被洗脱下去，所以可与蛋白质反响虽然比较缓慢，但可以被洗脱下去，所以可用来对电泳条带染色。用来对电泳条带染色。11 3不可运用石英比色皿因不易洗去染色，可用玻璃比色皿，运用后立不可运用石英比色皿因不易洗去染色，可用玻璃比色皿，运用后立刻用少量刻用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。的乙醇荡洗，以洗去染色。 4H+浓度是影响线性关系的主要要素，控制好显色液的浓度是影响线性关系的主要要素，控制好显色液的H+浓度就