总RNA提取试验原理

1、总RNAI取实验原理、步骤和问题解答Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试齐I。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，裂解细胞并释放出RNA酸性条件使RNADNA#离，加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA寸于样品间标准化RNA的产量十分有用。无论是人、动物、植物还是细菌组织，各种样品最大使用量（1mlTrizol）,动物组织（50mg）,植物组织（100mg）,丝

2、状真菌（100mg）,动物细胞（5X106-1X107）,酵母（1X107）。TRIZOL试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的析出。例如，从大鼠肝脏抽提的RNAg脂糖凝胶电泳并用溟化乙咤染色，可见许多介于7kb和15kb之间不连续的高分子量条带，（mRN母口hnRNA成分）两条优势核糖体RNA条带位于5kb（28S）和2kb（18S），低分子量RNA介于0.1和0.3kb之间（tRNA,5S）。当抽提的RN刖TE稀释时其A260/A280比值/.8。实验用品【实验耗材】1、移液枪：1ml、2004>20J、10J、2plo酒精擦拭，头部重点，紫外线照射。2、吸头：1ml、200

3、20pl3、匀浆管：5ml4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20M吸头的一个5、EP管：1.5ml、0.2ml、100M6、试剂瓶：2个60ml的棕色广口试剂瓶。青霉素小瓶（分装无水乙醇，高压的DEPCK,20°C保存）。7、量筒：50ml、250ml、500ml8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml9、试管架：5ml、1.5ml、20410、盐水瓶：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPCC11、铝制饭盒：4个12、塑料小饭盒：1个13、大瓷缸：2个14、锡泊纸：一卷15、卷纸：2卷16、三角烧瓶：带盖，稍大（融琼脂糖）【实验仪器】天平、振荡

4、器、高速离心机、0.510ul、20200ul、1001000ul加样器。【自备试剂】DEPC焦碳酸二乙酯）,氯仿，异丙醇，无水乙醇，0.050.1%DEPC-H2O75%乙醇，TE缓冲液，琼脂糖。RNAtt提的准备工作【试剂配制】1.DEPC水：1ml+1000ml双蒸水=1%）DEPC水，1000ml容量瓶中静置4小时。2.75%乙醇：无水乙醇+DEPCK,-20C保存（DEPCK需先高压）3 .氯仿：棕色瓶4 .异丙醇：棕色瓶【器具处理与准备】1 .塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管等）先将DEPCK从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，小枪头需打入DEPCC,室温过夜，高压，

5、烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP管）。胶塞同样处理。塑料器皿也可在0.5MNaOH中浸泡10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。2 .玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，1%oDEPC±夜，蒙锡纸，150°C烘烤4h,180°C,2h。或泡酸过夜，冲洗干净后高温烘烤，1%°DEPC±夜，高压。盛装乙醇，DEPOK用。3 .匀浆器：（包括剪刀、镣子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC实验内容和方法一、抽提（一）组织抽提1 .组织取材后用灭菌的锡箔纸包好保存于液氮。实验时，在液氮中将组织研磨成粉末，趁液氮未挥发将粉末转移到EP管，室

6、温5000rpm离心去上清。每50-100mg组织，加入1mlTrizol。2 .若是新鲜标本经匀浆后转移离心管，加入1mlTrizol。3 .若组织量（110mg）或细胞数很少（102104）,在样品中加入800ulTrizol反复抽吸均匀，再加入糖原（终250ug/ml）,剧烈振荡或用匀浆器匀浆。4 .在匀化后和加入氯仿之前，样品可以在£070°C保存至少一个月。（二）细胞抽提1 .倒掉培养基，PBS洗，直接将1mlTrizol注入培养瓶（5X106）,反复抽吸均匀。2 .或收集细胞后加入Trizol反复抽吸均匀。二、分相3 .在装有裂解物的离心管中加入0.2ml的氯仿

7、（为Trizol总体积的1/5）,振荡混均30秒，室温下静置5分钟.4 .12000rpm15分钟4°C,分相为三层。上层：RNA的为Trizol的60%）;中间：DNA下层：蛋白质（酚-氯仿）。5 .小心吸取上清液，转移到另一EP管中。1ml裂解物产生的上清液体积约为0.40.6ml。有机相和中间层含有DN所口蛋白质，避免触及。三、RN阳淀6 .上清液加入约0.5ml的异丙醇，振荡混均30秒。室温下静置10分钟。7 .离心12000rpm10分钟4°C。8 .RNA沉淀将在离心底的侧面形成。小心吸弃上清液，注意避免吸弃RNM淀。四、RNA青洗9 .离心管加入1ml预冷的7

8、5无醇（1mlTrizol至少1ml乙醇清洗DNA）,振荡混均30秒，使沉淀振荡起来，室温12000rpmX12分钟。（有文献称不超过7500g离心）。尽可能吸弃上清液，防止RNA沉淀丢失。重复以上清洗步骤一次。在75无醇中，RN解4c至少保存1周，20c至少保存1年。10 .室温选择流动性小，倒置离心管于滤纸上，干燥RNA但不能完全干燥（510分钟）。用DEPC水15J溶解沉淀，55-60C孵育1015分钟。11 .测量OD直后，样品放置70c保存，一个月五、RNADN顺度的计算取78plDEPC水加2pl第10步液体，则稀释倍数为40倍。【RNA=A260X40Xn/1000闻/4【DNA

9、=A260X50Xn/1000闻/J（n为稀释倍数）分离RNA勺理想效果是A260/A280=1.82.0A260弋表RNAODM;A280弋表蛋白OD直注意事项1.RNA产量：每1mg组织或1X106培养细胞预期的RNA5fc量肝和脾，610pgo(2)肾，34闻骨骼肌和脑组织，11.5闻胎盘，1-4闻(5)上皮细胞(1X106,815闻culturedcells)(6)纤维母细胞(1X106,57闻culturedcells)2 .电泳检测：制备甲醛变性，1%琼脂糖凝胶快速电泳，25ug/lane,65V,2.5h,检测RNA分子完整性，观察18S、28S条带。3 .RNA沉淀完全干燥，会

10、极大地降低可溶性。部分溶解的RNAMA260/280比值&1.6。用移液管尖分几次移取无RNAS的水或0.5%SDS溶解RNA并在5560下孵育10分钟，当RNAiZ后要用于酶切反应时，避免使用SDS对于胰腺，肾等组织中RNase含量很高，沉淀用100/离子甲酰胺溶解，01保存。4 .分离RNA的理想效果是A260/A280=1.82.0【分离胶范围】<500bp1.21.5%>10kp0.30.7%二者之间0.81.0%【分析和定量】紫外分光光度计测定A260及A280来定量分析RNA勺纯度及浓度。用什么稀释的RNA就用其调零。5 .预防RNAB污染6 .在分相步骤吸取上

11、清液过程中，和清洗步骤吸弃上清液过程中，都应在不触及其他相或沉淀的前提下吸取尽可能多的上清液。7 .台式离心机最大能达到2,600内的离心力，如果将离心时间延长到30-60分钟可以满足操作。8 .当TRIZOL用量少于2ml时建议使用清洁的一次性的聚丙材质试管。TRIZOL用量较大时，可以使用玻璃试管(Corex)或聚丙材质试管，事先检验以确保该试管可以耐受加入TRIZOL和氯仿后12,000沟的离心力。不可使用有裂缝或者破损的试管。离心前小心平衡试管。离心前玻璃管口必须盖上铝箔并用石蜡膜封口，聚丙烯管必须盖紧。9 .用TRIZOL抽提RNA时要戴手套和护眼罩。避免接触皮肤和衣服。在化学通风橱

12、完成操作。避免呼吸道吸入。【疑难解答】一、无RNA沉淀1.匀浆不完全：匀浆不完全时，基因组DN粉子仍然很大，溶液粘稠。变性的蛋白质和基因组DNA-起形成絮状凝集物容易包裹RNA使之不能有效地释放到溶液中。2.沉淀不完全：从小于2X105动/植物细胞、小于2mg动物组织、小于4mg植物组织或RNA含量低的动/植物组织中提取RNA寸，匀浆体积太大，将造成RNAi分稀释而不能沉淀下来。当从这样的样品中提取RNAM,应按比例减少抽提溶液。二、抽提率低1 .系统超负荷：如果过多增加单位体积内的样品量，将引起系统超负荷。系统超负荷常导致匀浆不完全、单位体积内的DN所口蛋白质所占比例增大，使RNA不能有效地

13、释放到上清中。系统超负荷还会导致相分离困难，降低RNA沉淀效率.2 .样品均化或裂解不完全：匀浆不完全时，RNA分子易被蛋白质和基因组DNA复合物包裹，不能被有效释放。3 .终RNA完全溶解：未溶解的RNA丢失。4 .样品未及时处理或细胞生长过度：样品分离后短时间内细胞内RNA酶被激活，细胞生长过度同样会激活细胞内RNAB,若不及时提取RNA大部分RNA会被降解。若样品暂时不作RNA提取，应立即用液氮冷冻完全，置-80C贮存。三、A260/A280比率&1.651 .在分光光度计测量前用水而不是用TE缓冲液稀释RNA样品。低离子强度和低pH溶液会增加280nm处的光吸收值。2 .样品匀

14、浆化时所加的TRIZOL量太少。3 .匀浆化后样品没有在室温下放置5分钟。4 .分离的水样层中污染有苯酚层。5 .终RNAa有完全溶解。四、RNAW解1 .从动物体取下的组织没有立即进行抽提或冰冻保存。2 .用于抽提的样品，或抽提的RNA样品保存于5N0°C,而不是存放于号0。3 .细胞经胰酶消化而分散。4 .水溶液或试管污染有RNAB。5 .用于琼脂糖凝胶电泳的福尔马林pH低于3.5o6 .RNA在水溶液中呈酸性，易自发水解，应溶于TE,20C以下保存。？五、DNA亏染1 .样品匀浆化时所加的TRIZOL量太少。2 .用于抽提的样品包含有机溶媒（如乙醇，DMSO,强缓冲液或碱性溶液。六、蛋白多糖和多糖污染下述的对RNA沉淀方法改进能从抽提的RNA中移去复合污染。以匀浆化时每1mlTRIZOL为例，在水样层