水动力转染技术及在基因治疗方面的应用

1、精选优质文档-倾情为你奉上水动力转染技术及在基因治疗方面的应用李敏然1 孙殿兴1 李兵顺2 摘要 水动力转染技术是近年新出现的一种体内基因转染方法，是通过在血管内迅速注射大剂量的溶液来克服内皮和细胞膜的物理屏障作用进入实质细胞从而实现基因转染。除了可以转染DNA，还可用来转染RNA、蛋白质等其他小分子复合物物质,为基因治疗提供了一项简单而实用的动物实验手段。本文就有关水动力转染技术的原理、步骤及在基因治疗方面的应用前景作一综述。关键词 水动力； 尾静脉注射；基因治疗Abstract Hydrodynamic delivery has emerged as a new method for in

2、tracellular DNA delivery in vivo. Hydrodynamic delivery employs the force generated by the rapid injection of a large volume of solution into the incompressible blood in the circulation to overcome the physical barriers of endothelium and cell membranes that prevent large and membrane-impermeable co

3、mpounds from entering parenchymal cells. In addition to the delivery of DNA, it is useful for the efficient intracellular delivery of RNA, proteins, and other small compounds in vivo. This method is simple and effective for gene therapy.This review discusses the principal, process and potential appl

4、ication in gene therapy of hydrodynamic delivery. Key word Hydrodynamic; injection via tail vain; gene therapy外源基因导入受体细胞的途径包括：运用生物原理（病毒载体转染法等）、化学原理（脂质体转染法、多聚体转染法等）及物理原理（显微注射法、电穿孔法、水动力学方法等）等多种基因转染方法。水动力转染技术作为目前比较新颖的转染方法，已经成为进行基因治疗研究的几种首选方法之一。从理论上讲，水动力转染通过在血管内迅速注射大剂量的溶液产生动力克服内皮与细胞膜的物理屏障作用，从而使转染物质进入组织细

5、胞中。实际应用中，水动力转染技术可以用来进行DNA、RNA、蛋白质、聚合体及不能渗透细胞膜物质的转染。下面将介绍水动力转染技术的原理、操作步骤及在基因治疗方面的应用，展望水动力转染技术的发展前景。作者单位：1.石家庄白求恩国际和平医院肝病科 2.石家庄市五院四科室 一、水动力转染技术的原理1996年，Budker等1首先报道了短时间内在小鼠门静脉注射含报告基因的质粒的高渗溶液，同时短暂结扎肝静脉后，在肝细胞中能检测到该基因的表达产物。该研究表明转染基因的表达水平与注射溶液的剂量成正相关，即肝内注射的溶液剂量越大，报告基因的表达水平也随之升高。通过这项结果可以推理出短时间内注射溶液产生的水动力可

6、促使DNA进入肝细胞，从而产生基因表达。由于需要较高水平的外科手术才能使实验结果达成基本一致，故他们的研究方案没有得到推广。后Zhang2和Liu3等人从小鼠尾静脉快速注射相当于其重量8%-10%的DNA溶液产生了较高的基因表达，至此，此方法被正式命名为水动力转染，随之也建立了水动力转染的原理，即大剂量溶液和快速注射是导入基因的推动力量。水动力转染后在肝脏、肾脏、心脏、脾脏及肺脏中观察到了转染基因的表达，肝脏表达水平最高。实验动物能很好的耐受此方法，组织化学和血清生化学研究均表明动物组织没有受到损害，短暂的肝酶升高会在三天内恢复正常。由于简单、易行、高效且无毒副作用，此方法成为在鼠体内进行DN

7、A，RNA等转染后研究基因治疗的首选方法之一。给小鼠尾静脉快速注射大量溶液后首先影响心脏，心律紊乱持续约1分钟，心率从510次/分钟迅速降至280次/分钟，3s后缓慢升高，由于心率大幅度降低4，大量DNA溶液在下腔静脉中堆积，此区域形成高的流体压力，该压力促使DNA溶液逆流到与下腔静脉直接相连的器官如肝脏、肾脏等器官，DNA溶液从下腔静脉经肝静脉逆流回肝脏，局部静脉腔的压力升高，肝血窦内压力随之升高，血窦内皮细胞窗孔扩大，压力施加到肝细胞膜的肝窦面上，当压力达到一定程度时，肝细胞膜出现破损，接近肝细胞膜破损处的DNA进入肝细胞，同样由于高压而进入细胞核。随着时间的延长，压力会逐渐下降，肝细胞进

8、行修复，机体内环境重新恢复正常，DNA则成功地留在了肝细胞内，实现了基因的转染。但只有40%的肝细胞存在基因转染且分布不均匀，大多数基因转染的细胞分布在中央静脉周围。分析其原因，考虑肝小叶内血管无论从结构上还是分布上都不均一，与门静脉末支相连的血窦较窄且曲折，而中央静脉周围的血窦相对较宽且直，水动力静脉注射后，溶液逆流到门静脉末支相连的血窦和中央静脉附近血窦相通的区域，由于门静脉末支相连的血窦较窄且曲折，溶液积聚在中央静脉附近血窦中，只有少数溶液达到门静脉末支相连的血窦，限制了其周围肝细胞的转染，所以大多数基因转染的细胞在中央静脉周围4。一系列结构不相似的复合物如聚乙烯乙醇、免疫球蛋白、乳糖化

9、蛋白、基因组RNA和siRNA等通过水动力注射均达到高效转染，说明了水动力转染入肝细胞是非特异吸收的。目前大多数学者认同水动力转染进入肝细胞的原理是由于在肝细胞膜的肝窦面上产生破损的小孔，从而允许被转染物进入肝细胞。 但是也有学者提出质疑，单纯机械力使基因转染的说法无法解释为何仅肝细胞而肝组织内其他细胞无表达，同样，为何肌肉组织内的肌纤维细胞表达6，而内皮细胞和非实质细胞同样暴露在水动力产生的机械力下，但是后者无表达。后来国外研究者进行深入的研究，发现水动力注射后在中央静脉附近的肝细胞内存在小囊泡，一些囊泡内可以观察到被标记的转染物质，考虑小囊泡可能是转染物质进入的又一个途径7，8。Kobay

10、ashi N9等报道用水动力法给小鼠注射小分子量的PEG400和大分子量的111In-Ing后，肝细胞内的111In-Ing升高而PEG400未见增高，推测可能在流体压力下细胞膜上出现一些暂时存在的孔，小分子物质进入细胞后又很快被扩散出来，因此，水动力转染DNA与其分子大小有关。学者们就水动力注射后细胞膜上的破损孔的维持时间进行了研究4，10，发现运用连续注射法，即在水动力注射盐水后，随即缓慢注射小剂量含报告基因或不能渗透细胞膜的荧光报告基因的小剂量溶液，在鼠体内水动力注射后1分钟，大量破损孔开始修复，注射10分钟后行第二次注射仍可在肝内观察到微量的报告基因表达。但是目前为止还没有弄清水动力注

11、射后少量的细胞破损孔会持续长时间存在的原因。也有学者从肾动脉行水动力注射进行肾脏的转染11及从大隐静脉注射行肌肉转染6，原理与尾静脉注射类似。二、水动力转染技术的操作步骤自从1999年首次报道水动力转染技术的应用后，为满足各种试验的需求，学者们在不断地优化具体的操作步骤。水动力学转染技术操作的成败与动物体重、注射溶液的体积、注射持续时间和DNA的量等因素密切相关。根据实验动物和转染的目的器官不同，选择注射的血管不同，一般，肝脏转染，均选择尾静脉注射；肾脏转染，兔子选择肾静脉；肌肉转染，均选择大隐静脉。注射的溶液量根据动物体重而定，在啮齿类动物，尾静脉注射的最佳量约为动物体重的10%；大隐静脉注

12、射时，兔子为体重的2%、小鼠为体重的3%、狗为体重的2-3%。注射持续时间，小鼠尾静脉注射一般为5-7秒，兔子肾静脉注射时为5秒、尾静脉注射时为15秒、大隐静脉注射时为15-30秒。溶液中所含DNA的量，大鼠的最佳剂量为3/，兔子为7/，小鼠为0.5-2.5/3,6。如果注射剂量不变，提高注射速度，针对内皮和细胞膜的压力会增加，转染效率会增高,但是，注射速度的提高和/或注射剂量的加大会使组织的受损加重，甚至导致动物死亡。水动力注射经常采用盐溶液作为介质，常用复方氯化钠注射液和磷酸盐缓冲液。有学者证明提高渗透能力比提高水动力压力会更有效的减少注射剂量。另外，水动力注射后给予动物肝脏按压，会有效的

13、提高转染效率,其中以肝脏按压4次每次1秒效果最好12。当采用局部注射后，阻断该组织的血流也会明显提高转染率。三、水动力转染技术在基因治疗方面的应用水动力转染为基因治疗提供了新的转染途径，由于简单、易行、高效且毒副作用小，该方法已经广泛应用于动物实验中进行不同脏器的各种疾病的基因治疗研究。首先已广泛应用于肝病领域，近年来siRNA治疗肝病显示了其潜在的良好的效果，它通过降解与目的基因相似的双链RNA可致靶基因沉默。应用水动力学同时注射表达HBV的质粒和携带针对HBV的小干扰RNA质粒后，表达HBV的质粒被肝脏有效摄取并表达HBV基因，产生短暂性的病毒复制，同样siRNA被摄取后在肝细胞内表达，直

14、接抑制HBV复制13。HCV 基因组是一个单股正链RNA 结构,既能当作病毒mRNA 进行蛋白翻译,又可作为模板进行病毒复制,水动力注射针对HCV RNA的siRNA后，HCV RNA 水平下降，受HCV RNA 感染的细胞数也降低了。在应用刀豆球蛋白a、四氯化碳等造慢性肝损伤的动物模型后水动力注射白介素-22后可以抗肝损伤、坏死及凋亡，显示白介素-22在治疗人类肝病的潜力14。 现在针对肿瘤治疗有诸多方案，以肿瘤血管内皮细胞为靶点的治疗措施可分为血管靶向（vascular target）和抗血管形成（antiangiogenic）两种。前者针对肿瘤已有的血管，后者抑制肿瘤新生血管的生长。血管

15、他丁和内皮他丁是血管生成的自然抑制因子，给予黑色素瘤的小鼠同时水动力注射血管他丁和内皮他丁基因，可以75%抑制皮肤肿瘤生长及80%抑制肺部转移癌的生长，是针对肿瘤血管内皮为靶点的抗血管新生治疗的有效治疗方案15。胎肝激酶-1是血管内皮生长因子受体，最近有学者用水动力转染含融合性胎肝激酶-1基因的质粒，鼠血清融合性胎肝激酶-1蛋白达到0.1mg/ml，抑制了内皮生长因子导致的肿瘤的血管新生，有效抑制了皮肤肿瘤、肾细胞瘤及肺癌16。目前许多研究表明，水动力转染可使抗肌萎缩蛋白基因有效的进入肌细胞。另外通过尾静脉或肢体静脉水动力注射表达抗原的裸基因载体，在小鼠、大鼠及兔子体内可产生高滴度、特异性的抗

16、体，因此是一种有效的基因免疫途径17。此外，还利用水动力转染研究了许多其他能起到治疗作用细胞因子基因、生长因子基因、遗传病基因和病毒基因。实践中，任何有治疗潜力的基因尤其是可分泌蛋白的基因可以应用水动力转染在动物体内进行研究。四、总结和展望与显微注射法，粒子轰击法和电击法类似，水动力转染应用物理力学将转染物质穿过细胞膜，从而进入胞质，但水动力转染不需要特殊设备及试剂，普通实验室即可以操作。除了针头和针管，盐水和被转染物质是水动力转染法仅需的。自从1999年水动力转染技术出现后，多个实验室运用其进行不能渗透细胞膜的物质的转染。原则上讲，成功应用水动力转染取决于两点：组织内皮细胞和周围实质细胞的结

17、构。尽管动脉或静脉由于内径较大被选为注射的血管，但真正进行细胞转染的场所在毛细血管。毛细血管按其内皮的完整性分两类：连续的和有孔的。在连续型的毛细血管中，血管内皮细胞允许水分子、小分子溶解物及脂溶性物质自由出入，而限制大分子出入。相反，有孔型毛细血管的内皮细胞允许血液成分例如血清蛋白与外界进行交换。实验证明水动力转染均可应用于这两种毛细血管。一般来讲，连续型毛细血管进行基因转染需要的压力要比有孔型毛细血管大。除了在鼠尾静脉进行水动力转染外，还有待系统的研究出针对两种不同毛细血管的实验条件。局部注射时，阻断血流会降低所需注射剂量。将来会针对不同的器官建立不同的水动力学转染步骤。水动力学技术除可应

18、用在基因治疗领域，还广泛应用在建立人肝炎病毒的动物模型及获取目的蛋白等多个领域。目前简单、易行且高效的水动力转染已经激发了学者们将其运用到临床的兴趣。但由于其需要注射大剂量溶液才能达到效果，人类不可能承受这样的剂量，故目前的研究集中在如何优化程序以显著减少注射含目的基因的溶液的量。目前已经有一些用于大动物上的值得鼓舞的报道。有学者将狗或灵长类动物的肢体末端用止血带短时间控制血流，并从肢体静脉注入DNA或siRNA后可在其肌肉内达到有效转染。还有学者设计了几种方法将基因转染入被阻断肝静脉的兔子肝脏中，他们应用球囊状导管，在兔子体内证明注射剂量和速度是人体内快速注射所能耐受的。不过缺少合适的导管来

19、满足注射的需要限制了其发展。一旦这些问题被解决，水动力转染在临床的应用会有很大的进展。参考文献：1 Budker V, Zhang G, Knechtle S, et al. Naked DNA delivered intraportally expresses efficiently in hepatocytes. Gene Ther ,1996,3:593-598.2 Zhang G, Budker V, Wolff J A. High leves of foreign gene expression in hepatocytes after injection of naked plas

20、mid DNA. Hun Gene Ther,1999,10:1735-1737.3 Liu F, Song Y, Liu D. Hydrodynamics-based transfection in animals by administration of plasmid DNA. Gene Ther,1999,6:1258-1266.4 Zhang G, Gao X, Song YK, et al. Hydroporation as the mechanism of hydrodynamic delivery. Gene Ther,2004,11: 675-682.5 Rossmanith

21、 W, Chabicovsky M, Herkner K, et al. Cellular gene dose and kinetics of gene expression in mouse livers transfected by high-volume tail-vein injected of naked DNA. DNA Cell Biol,2002,21: 847-853. 6 Hagstrom, J. E., Hegge, J., Zhang, G., et al. A facile non-viral method for delivering genes and siRNA

22、s to skeletal muscle of mammalian limbs. Mol Ther,2004,10:386398.7 Crespo A, Peydro A, Dasi F, et al. Hydrodynamic liver gene transfer mechanism involves transient sinusoidal blood stasis and massive hepatocyte endocytic vesicles. Gene Ther,2005,12: 927-935. 8 Vladimir G. Budker , Vladimir M. Subbot

23、in , Tatiana Budker ,et,al. Mechanism of plasmid delivery by hydrodynamic tail vein injection. II. Morphological studies .J Gene Med,2006 Jul,8(7):874-88.9 obayashi N, Kuramoto T, Yamaoka K,et al. Hepatic uptake and gene expression mechanisms following intravenous administration of plasmid DNA by co

24、nventional and hydrodynamics-based procedures. J Pharmacol Exp Ther ,2001 Jun,297(3):853-60.10 Kobayashi, N., Nishikawa, M., Hirata, K.,et al. Hyrodynamics-based procedure involves transient hyperpermeability in the hepatic cellular membrane: Implication of a nonspecific process in efficient intrace

25、llular gene delivery. J Gene Med,2004,6:584592.11 Maruyama H, Higuchi N, Nishikawa Y,et al. High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection. J Gene Med,2002, 4:333341.12 Liu F,Huang L. Noninvasive gene delivery to the liver by mechanical massage. Hepatology,2002 Jun,35(6):1314-9.13 McCaffrey AP, Nakai H, Pandey K, et al. In