第四章定量分析与分析方法验证

1、 第四章第四章 药物定量分析与药物定量分析与 分析方法验证分析方法验证 第一节第一节 定量分析样品的前处理方法定量分析样品的前处理方法 一、概述一、概述 1.1.为什么要对定量分析的样品进行前处理？为什么要对定量分析的样品进行前处理？ 含卤素有机药物含卤素有机药物 R-X （F，Cl, Br, I ） 金属有机药物金属有机药物 R-O-Me（有机酸或酚的（有机酸或酚的 含金属有机药物含金属有机药物 金属盐；结合不牢固）金属盐；结合不牢固） 有机金属药物有机金属药物 R-Me （结合牢固）（结合牢固） 2. 常用的处理方法常用的处理方法 不经有机破坏的分析方法不经有机破坏的分析方法 药物分析中常

2、用的分析方法药物分析中常用的分析方法 经有机破坏的分析方法经有机破坏的分析方法含卤素有机药物含卤素有机药物 含卤素有机药物系指药物分子结含卤素有机药物系指药物分子结构中所含卤素直接与芳环或脂肪链相构中所含卤素直接与芳环或脂肪链相连者，而不包括某些有机药物的卤酸连者，而不包括某些有机药物的卤酸盐或氢卤酸盐盐或氢卤酸盐结构特点：结构特点：CX（一）卤原子的活泼性（一）卤原子的活泼性1. 1. 卤原子与碳原子直接相连，卤原卤原子与碳原子直接相连，卤原子的活泼性和它直接相连的烃基的结子的活泼性和它直接相连的烃基的结构有很大关系构有很大关系（1）乙烯型卤和芳卤）乙烯型卤和芳卤 不活泼不活泼CH2CH X

3、X（2）烯丙型卤和苄卤）烯丙型卤和苄卤 活泼活泼CH2XCH2CH CH2X（3）卤代烷型）卤代烷型 介于两者之间介于两者之间CH2CH (CH2)nX n22. 分子中所含卤原子的个数分子中所含卤原子的个数 分子中所含卤原子的个数越多，分子中所含卤原子的个数越多，活泼性越强，特别是同一碳上含多个活泼性越强，特别是同一碳上含多个卤原子或一个苯环上含多个卤原子时，卤原子或一个苯环上含多个卤原子时，活泼性增强更加明显活泼性增强更加明显3. 卤素的种类卤素的种类IBrClF常见的含卤素有机药物常见的含卤素有机药物CCH3OHCH3CCl3CCl3Cl3C三氯叔丁醇三氯叔丁醇六氯对二甲苯六氯对二甲苯C

4、OOHIIINHCOCH3CH3CONH泛影酸泛影酸COOHIIINH C(CH2)4OC NHOCOOHIII胆影酸胆影酸COOHIIICONHCH3CH3CONH碘他拉酸碘他拉酸IH2NIICH2CHCOOHC2H5碘番酸碘番酸碘苯酯碘苯酯CHCH3(CH2)8COOCH2CH3I盐酸胺碘酮盐酸胺碘酮OCH2CH2CH2CH3COOCH2CH2N(C2H5)2IIHClHNNFNC2H5OCOOH诺氟沙星诺氟沙星OFFCH3HHOHCH3CCH2OCOCH3OOOCCH3CH3醋酸氟轻松醋酸氟轻松BrBrBrBrCCOOHOSO3NaSO3NaOH磺溴酞钠磺溴酞钠含金属有机药物的分析含金属

5、有机药物的分析 含金属的有机药物：含金属的有机药物：金属原子不与碳金属原子不与碳原子直接相连，通常为有机酸及酚的原子直接相连，通常为有机酸及酚的金属盐或配位化合物金属盐或配位化合物 如如酒石酸锑钾、葡萄糖酸锑钠、酒石酸锑钾、葡萄糖酸锑钠、富马酸亚铁富马酸亚铁 有机金属药物有机金属药物：金属原子直接与碳：金属原子直接与碳原子以共价键相连，结合比较牢固原子以共价键相连，结合比较牢固 如如卡巴胂、醋酸苯汞、汞撒利卡巴胂、醋酸苯汞、汞撒利CCHOCHOOOCOOSbSbOOCOOOCHOCHC2K+ 3H2O酒石酸锑钾酒石酸锑钾CCHCCOOOFeOMg(C17H35COO)2硬脂酸镁硬脂酸镁富马酸亚

6、铁富马酸亚铁CH2OHCHOHCHOCHOCHOCOO-SbOHOSbO-OCHCHCHCCHOOCH2-OOHOHONa39H2O葡萄糖酸锑钠葡萄糖酸锑钠NHCONH2AsOOHHO卡巴胂卡巴胂HgOCOCH3醋酸苯汞醋酸苯汞OCH2COONaCONHCH2CHCH2HgOHOCH3汞撒利汞撒利HCCOOCCH OOFe（二）经水解后测定法（二）经水解后测定法 1. 直接回流后测定法直接回流后测定法 例如：三氯叔丁醇的含量测定例如：三氯叔丁醇的含量测定 CCl3-C(CH3)2-OH + 4NaOH (CH3)2CO +3NaCl + HCOONa +2H2O NaCl + AgNO3 Ag

7、Cl + NaNO3 AgNO3 + NH4SCN AgSCN + NH4NO3 2. 用硫酸水解后测定法用硫酸水解后测定法 例如：硬脂酸镁的含量测定例如：硬脂酸镁的含量测定 Mg(C17H35COO)2 + H2SO4 MgSO4 + 2C17H35COOH H2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2H2O （三）经氧化还原后测定法（三）经氧化还原后测定法 1. 碱性还原后碱性还原后测定测定 例如：泛影酸的含量测定例如：泛影酸的含量测定 2. 酸性还原后酸性还原后测定测定 例如：碘番酸的含量测定例如：碘番酸的含量测定 Zn还原还原 后银量法后银量法 COOHIIINHCOCH3CH3C

8、ONHCOOHH2NNH2+ 11NaOH + 3Zn+ 3NaI + 2CH3COONa + 3NaZnO2 + 3H2O NaI + AgNO3 AgI + NaNO3 3. 利用药物中可游离的金属离子的氧化性测定含量利用药物中可游离的金属离子的氧化性测定含量 （1）含锑药物）含锑药物 例如：葡萄糖酸锑的含量测定例如：葡萄糖酸锑的含量测定 Sb5+ + 2KI Sb3+ + 2K+ + I2 I2 + 2Na2S2O3 2NaI + Na2S4O6 （2）含铁药物）含铁药物 2Fe3+ + 2KI 2Fe2+ + 2K+ + I2 I2 + 2Na2S2O3 2NaI + Na2S4O6H

9、+ 三、经有机破坏的分析方法三、经有机破坏的分析方法 湿法破坏湿法破坏 药物分析中常用的有机破坏的方法有药物分析中常用的有机破坏的方法有 干法破坏干法破坏 HNOHNO3 3-HClO-HClO4 4法法 氧瓶燃烧法氧瓶燃烧法( (一一) )湿法破坏湿法破坏 HNOHNO3 3-H-H2 2SOSO4 4法法 H H2 2SOSO4 4- -硫酸盐法硫酸盐法 HNOHNO3 3- H- H2 2SOSO4 4-HClO-HClO4 4法；法； H H2 2SOSO4 4-H-H2 2O O2 2； H H2 2SOSO4 4-KMnO-KMnO4 4( (二二) )干法破坏干法破坏 加加NaN

10、a2 2COCO3 3或或MgOMgO以助灰化；温度控制在以助灰化；温度控制在420420 ( (三三) )氧燃瓶燃烧法氧燃瓶燃烧法 (oxygen flask combustion method) 1. 仪器装置仪器装置 500ml, 1000ml, 2000ml, 磨口、硬质玻璃磨口、硬质玻璃 锥形瓶锥形瓶 2. 称样称样 固体样；液体样要求详见固体样；液体样要求详见P163 3. 燃烧分解操作法燃烧分解操作法 4. 吸收液的选择吸收液的选择 用于用于X、S、Se等的鉴别、检查、含量等的鉴别、检查、含量 测定时多数是测定时多数是H2O或或H2O-NaOH；少；少 数为数为H2O-NaOH-

11、H2O2.7mm50mm30mm尾部尾部7mm13mm20mm25mm35 6mm16 6mm滤纸滤纸滤纸滤纸AGFEDCB氧瓶燃烧装置氧瓶燃烧装置应用示例：碘苯酯的测定应用示例：碘苯酯的测定ICHCH3(CH2)8-COOC2H5I2O2(I )_I2 + 2NaOH NaIO + NaI + H2O 3NaIO NaIO3 + 2NaI 3Br2 + I +3H2O IO3 + 6HBrBr2(guo) + HCOOH HBr + CO2 IO3 + 5I + 6H 3I2 + 3H2OI2 + 2Na2S2O3 2NaI + Na2S4O6CH3COOH-+- 一、容量分析法一、容量分析

12、法 （一）容量分析法的（一）容量分析法的特点特点 操作简单、快速；操作简单、快速； 比较准确（比较准确（RSDRSD0.2%0.2%）；）； 仪器普通易得。仪器普通易得。（二）容量分析法的（二）容量分析法的计算计算问题问题 1. 1. 滴定度滴定度（T T）的概念）的概念 每每1mlmol1mlmol溶液相当于被测物质的量溶液相当于被测物质的量(mg)(mg) 2. 2. 滴定度的计算滴定度的计算 a a A A + + b b B cB c C C + + d d D D T T = = M M b b / / a aB B 3. 3. 百分含量的计算百分含量的计算 （1 1）直接滴定法）直

13、接滴定法 D% = D% = V V F F T/WT/W 100%100% F F = = 实际标定的浓度实际标定的浓度/ /规定的浓度规定的浓度 （2 2）间接滴定法（回滴定法；剩余滴定法）间接滴定法（回滴定法；剩余滴定法） D% = D% = （V VO O V VB B) ) F F T T/ /W W 100%100% 二、光谱分析法二、光谱分析法 （一）紫外（一）紫外- -可见分光光度法（可见分光光度法（200nm200nm760nm)760nm) 灵敏度高，可达灵敏度高，可达10-4g/ml 10-7g/ml 1. 特点特点 准确度高，准确度高，RSD（%）为）为2% 5%5%

14、仪器价格低廉，操作简单，易普及，应用仪器价格低廉，操作简单，易普及，应用 范围广。范围广。 2. 2. 朗伯朗伯- -比耳定律比耳定律 A = ECL EA = ECL E1%1%1 1cmcm = = 10/M10/M 3. 3. 仪器校正和检定仪器校正和检定 波长校正用汞灯中较强谱线波长校正用汞灯中较强谱线237.38,253.65,275.28,296.73,237.38,253.65,275.28,296.73, 313.16,334.15,365.02,404.66,425.83,546.07nm 313.16,334.15,365.02,404.66,425.83,546.07nm

15、与与576.96nm576.96nm 或用仪器中氘灯的或用仪器中氘灯的486.02nm486.02nm与与656.10nm656.10nm进行校正。进行校正。 吸收度的检定：用吸收度的检定：用K K2 2CrOCrO7 7(60mg)+0.005mol/LH(60mg)+0.005mol/LH2 2SOSO4 4液至液至1000ml1000ml 波长波长(nm) 235(nm) 235(最小最小) 257() 257(最大最大) 313() 313(最小最小) 350() 350(最大最大) ) E E1%1%1 1cmcm 124.5 144.0 48.62 106.6 124.5 144.

16、0 48.62 106.6 杂散光检查：杂散光检查： 试剂试剂 浓度浓度(g/ml) (g/ml) 测定波长测定波长 透光率透光率(%)(%) NaI 1.00 220nm NaI 1.00 220nm 0.80.8 NaNO NaNO2 2 5.00 340nm 5.00 340nm 0.80.8 4. 4. 对溶剂的要求对溶剂的要求: : 220 220240nm 241240nm 241250nm 251250nm 251300nm 300nm300nm 300nm以上以上 溶剂溶剂+吸收池吸收池A 0.41 0.41 0.20 0.20 0.10 0.10 0.050.05 5. 5.

17、 测定方法测定方法 要求供试品溶液的要求供试品溶液的A A应在应在0.3 0.3 0.70.7 对照品比较法：对照品比较法：C Cx x=(=(A Ax x/ /A Ar r) )C Cr r; ; 含量含量%=%=C Cx xD/WD/W100 %100 % 常用方法常用方法 吸收系数法：吸收系数法： 含量含量%= %= A Ax x /(/(E E1%1%1 1cmcm ) )r r 100 %100 % 计算分光光度法：计算分光光度法：V VA A的三点校正法的三点校正法 （二）荧光分光光度法（二）荧光分光光度法 灵敏度高灵敏度高，可达，可达10-10g/ml 10-12g/ml 在在低

18、浓度低浓度进行测定，防止进行测定，防止F与与C不成正比及自熄灭作用不成正比及自熄灭作用 1. 特点特点 用基准物溶液校正仪器灵敏度，防止样品液荧光衰减用基准物溶液校正仪器灵敏度，防止样品液荧光衰减 灵敏度高，但灵敏度高，但干扰因素多干扰因素多。 制备荧光制备荧光衍生物衍生物，可提高其灵敏度和选择性。，可提高其灵敏度和选择性。 用样品用样品量少量少，操作，操作简单简单，方法，方法快速快速，应用，应用范围范围较较广广。 2. 荧光分析仪荧光分析仪 有二个单色光器有二个单色光器激发单色光器与发射单色光激发单色光器与发射单色光 器；且激发光源、样品池和检测器成直角。器；且激发光源、样品池和检测器成直角

19、。3. 含量测定含量测定 常用的方法对照品比较法常用的方法对照品比较法:Ci = (Ri-Rib)/(Rr-Rrb) Cr Ch.P收载收载地高辛片、利血平片、洋地黄毒苷片。地高辛片、利血平片、洋地黄毒苷片。 三、色谱分析法三、色谱分析法 按分离原理分为：吸附；分配；离子交换；排阻色谱按分离原理分为：吸附；分配；离子交换；排阻色谱 方法分类方法分类 按分离方法分为：按分离方法分为：PC；TLC；柱色谱；柱色谱；GC，HPLC。 （一）（一）HPLC法法 1. 对对HPLC仪器一般要求仪器一般要求 色谱柱、流动相按品种项下要求。色谱柱、流动相按品种项下要求。 色谱柱的理论板数：色谱柱的理论板数：

20、n = 5.54(tR /Wh/2)2 2. 系统性试验系统性试验 分离度：分离度：R = 2（tR1 tR2)/(W1 + W2); 要大于要大于1.5 拖尾因子：拖尾因子：T = W0.05h/2d1 应在应在0.9 1.05 内标法加校正因子测定供试品中主成分含量内标法加校正因子测定供试品中主成分含量3. 测定方法测定方法 标准曲线法标准曲线法 外标法测定供试品中主成分含量外标法测定供试品中主成分含量 外标一点法外标一点法 应用示例：应用示例： RP-HPLC法测定盐酸黄酮哌酯片含量，用标准曲线法法测定盐酸黄酮哌酯片含量，用标准曲线法 如头孢拉丁；头孢羟氨苄；头孢唑啉钠用外标一点法如头孢

21、拉丁；头孢羟氨苄；头孢唑啉钠用外标一点法 （二）（二）GC法法 1. 对对GC仪器一般要求仪器一般要求 载气为载气为氮气氮气；色谱柱为填充或毛细管柱；色谱柱为填充或毛细管柱 色谱柱的理论板数：色谱柱的理论板数：n = 5.54(tR /Wh/2)2 2. 系统性试验系统性试验 分离度：分离度：R = 2（tR1 tR2)/(W1 + W2); 要大于要大于1.5 拖尾因子：拖尾因子：T = W0.05h/2d1 应在应在0.9 1.05 内标法加校正因子测定供试品中主成分含量内标法加校正因子测定供试品中主成分含量 3. 测定方法测定方法 标准曲线法标准曲线法 外标法测定供试品中主成分含量外标法

22、测定供试品中主成分含量 外标一点法外标一点法 应用示例：应用示例： Ch.P(2000)收载的月桂卓酮、维生素收载的月桂卓酮、维生素E及其片剂、注及其片剂、注 射剂、甲酚皂溶液等均采用射剂、甲酚皂溶液等均采用GC法中的内标法加校正法中的内标法加校正 因子测定含量。因子测定含量。 第三节第三节 药品质量标准分析方法验证药品质量标准分析方法验证 一、准确度一、准确度 是指用该方法是指用该方法测定结果与真实值接近的程度，测定结果与真实值接近的程度，用用回收率回收率表示表示 （一）含量测定方法的准确度（一）含量测定方法的准确度 1. 原料药原料药 可用已知纯度对照品或样品进行测定；或与已建准确可用已知

23、纯度对照品或样品进行测定；或与已建准确 度的另一方法测定的结果进行比较。度的另一方法测定的结果进行比较。 2. 制剂制剂 要考察要考察辅料对回收率的影响辅料对回收率的影响。采用在空白辅料中加入原。采用在空白辅料中加入原 料对照品的方法作回收率试验，然后计算料对照品的方法作回收率试验，然后计算RSD。 具体做法：测定高、中、低三个浓度，具体做法：测定高、中、低三个浓度，n=3, 共共9个数据来评价个数据来评价 回收率的回收率的RSD2%；用；用UV和和HPLC发时，一般回发时，一般回 收率可达收率可达98%102%；容量法可达；容量法可达99.7%100.3% （二）数据要求（二）数据要求 回收

24、率回收率% = （测定平均值（测定平均值 空白值）空白值）/加入量加入量100% 要求制备要求制备高高、中中、低低三浓度的样品，各测定三浓度的样品，各测定3次次。应。应报告已知加入量的回收率，或测定结果平均值与真实值报告已知加入量的回收率，或测定结果平均值与真实值之差及其可信限。之差及其可信限。 二、精密度二、精密度 是指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次测定结果是指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次测定结果 之间的之间的接近程度接近程度。 （一）精密度表示方法（一）精密度表示方法 1. 偏差偏差(deviation , d) d = 测得值测得值-平均值平均值=Xi-X 2.

25、 标准偏差标准偏差（standard deviation, SD或或S） S =(Xi X)2/(n-1)1/2 3. 相对标准差相对标准差(relative standard deviation, RSD)也称变异系数也称变异系数 (coefficient of variation, CV) RSD=标准偏差标准偏差/平均值平均值100%=S/X 100%（二）重复性、中间精密度及重现性（二）重复性、中间精密度及重现性 1. 重复性重复性 在相同条件下在相同条件下,由一个分析人员测定所得结果的精密度由一个分析人员测定所得结果的精密度. 2. 中间精密度中间精密度 在同一个实验室，不同时间由不

26、同分析人员用不在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不 同设备测定结果的精密度。同设备测定结果的精密度。 3. 重现性重现性 在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度。在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度。（三）数据要求（三）数据要求 应报告应报告S或或SD、RSD和可信限。用统计学的可和可信限。用统计学的可信性分析信性分析(t或或f）。）。 三、专属性三、专属性 是指在其他成分是指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等如杂质、降解产物、辅料等)可能存在下，可能存在下， 采用的方法能准确测定出被测物的特性。鉴别反应、杂质检采用的方法能准确测定出被测物的特性。鉴别反应、杂质检 查、含量测

27、定方法，均应考察其专属性。查、含量测定方法，均应考察其专属性。 （一）鉴别反应（一）鉴别反应 应能与其它共存的物质或相似化合物区分，不含被测组分应能与其它共存的物质或相似化合物区分，不含被测组分 的样品均应呈现负反应。的样品均应呈现负反应。 （二）含量测定和杂质测定（二）含量测定和杂质测定 色谱法和其他分离法，应附代表性的图谱，以说明专属性。色谱法和其他分离法，应附代表性的图谱，以说明专属性。 图中应注明各组分的位置，色谱法中分离度应符合要求。在能图中应注明各组分的位置，色谱法中分离度应符合要求。在能 获得杂质的情况下，可加到试样中，考察对结果的干扰。在杂获得杂质的情况下，可加到试样中，考察对

28、结果的干扰。在杂 质和降解物不能获得的情况下，可用以验证方法和药典方法进质和降解物不能获得的情况下，可用以验证方法和药典方法进 行对照；也可用对试样加速破坏的方法，比较两种方法。行对照；也可用对试样加速破坏的方法，比较两种方法。 四、检测限（四、检测限（limit of detection, LOD) 是指试样中被测物能被检测出的是指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量最低浓度或量，是限度检验，是限度检验 指标。它无需测定，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可。指标。它无需测定，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可。 （一）（一）常用的方法常用的方法 1.1.非仪器分析目视法非仪器分析目视

29、法 用已知浓度被测物，试验出能被可靠地用已知浓度被测物，试验出能被可靠地 检测出的最低浓度或量。检测出的最低浓度或量。 2.2.仪器分析方法仪器分析方法 UVUV法：法：LODLOD = = f f.3.3S S空空 = = C C样样/ /A A样样 3 3S S空空 FluFlu法：法：LODLOD = = f f.3.3S S空空 = = C C样样/(/(F F样样- -F F空空) ) 3 3S S空空 GCGC和和HPLCHPLC法：法： LODLOD = = S S/ /N N = 2 = 2或或3 3 （二）数据要求（二）数据要求 应附测试图，说明测试过程和检测限结果。应附测试

30、图，说明测试过程和检测限结果。 五、定量限（五、定量限（limit of quantitation, LOQ) 是指样品中是指样品中被测物能被被测物能被定量测定定量测定的最低量的最低量，其测定结果应，其测定结果应 具一定准确度和精密度。杂质和降解产物进行定量测定时，要求具一定准确度和精密度。杂质和降解产物进行定量测定时，要求 LOQLOQ. .常用信噪比法确定定量限，一般以常用信噪比法确定定量限，一般以S/N=10S/N=10时相应的浓度进行时相应的浓度进行 测定。测定。 六、线性六、线性 是指在设定的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接是指在设定的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接 呈

31、呈正比正比关系的关系的程度程度。 UVUV法：首先制备一个标准系列，浓度点法：首先制备一个标准系列，浓度点n =5; A = 0.3n =5; A = 0.3.0.7.0.7 建立回归方程建立回归方程C = aA + b ;C = aA + b ;r r 0.99990.9999。 HPLCHPLC法：制备一个标准系列，浓度点法：制备一个标准系列，浓度点n =5 n =5 7; 7; 以以C C对对h h或或A A或与或与 内标物的峰面积之比，建立回归方程内标物的峰面积之比，建立回归方程r r 0.99990.9999。 七、范围七、范围 是指达到一定精密度、准确度和线性、测试方法是指达到一定精密度、准确度和线性、测试方法适用的高低限度或量的区间适用的高低限度或量的区间。 原料药和制剂含量测定原料药和制剂含量测定：范围应为测试浓度的：范围应为测试浓度的80%- 120%。 制剂含量均匀度检查制剂含量均匀度检查：范围应为测试浓度的：范围应为测试浓度的70