第02章 生物制品制备的一般步骤

1、第二章 生物制品制备的一般步骤本章主要内容：本章主要内容：1. 1. 生物制品制备的一般步骤生物制品制备的一般步骤2. 2. 蛋白类生物制品的分离纯化方法蛋白类生物制品的分离纯化方法3. 3. 核酸类生物制品的分离纯化方法核酸类生物制品的分离纯化方法4. 4. 基因工程类生物制品的制备方法基因工程类生物制品的制备方法第一节第一节 生物制品制备的一般步骤生物制品制备的一般步骤一、原材料的选择和保存方法一、原材料的选择和保存方法原材料：原材料： 人体、动物、植物、微生物及海洋生物的组织、分泌物，人体、动物、植物、微生物及海洋生物的组织、分泌物，以及工程细胞、细菌及人工处理（如免疫）或改造过的动、以

2、及工程细胞、细菌及人工处理（如免疫）或改造过的动、植物。植物。（一）原材料选择依据和注意事项（一）原材料选择依据和注意事项1. 来源丰富，取材方便，价格便宜。来源丰富，取材方便，价格便宜。2. 来源清楚，质量稳定可控，最好有质量检验报告。来源清楚，质量稳定可控，最好有质量检验报告。3. 目标成分含量高，且易于与其他成分分离。故应注意动物目标成分含量高，且易于与其他成分分离。故应注意动物 的年龄、性别、生理状态，植物的生长时期（季节），微的年龄、性别、生理状态，植物的生长时期（季节），微 生物的对数生长期等。生物的对数生长期等。4. 由于是生物材料，故必须保持新鲜，可现用现取，或低温保由于是生物

3、材料，故必须保持新鲜，可现用现取，或低温保存备用，以防止腐败、变质及微生物污染。存备用，以防止腐败、变质及微生物污染。 低温保存时，应将非目标组织如动物组织中的结缔组织、低温保存时，应将非目标组织如动物组织中的结缔组织、脂肪组织，细菌的培养基等尽可能去掉。脂肪组织，细菌的培养基等尽可能去掉。（二）原材料的保存方法（二）原材料的保存方法1.1.低温保存。低温保存。短时间保存可在短时间保存可在-20-20，欲长期保存，则应在，欲长期保存，则应在- - 80 80或液氮中。或液氮中。不得对含有活性成分的生物材料反复冻融！不得对含有活性成分的生物材料反复冻融！2.2.脱水保存。脱水保存。使用丙酮将原材

4、料中的水分脱去。适应于少量价使用丙酮将原材料中的水分脱去。适应于少量价 值昂贵的原材料的保存。应注意，有机溶剂不能对活性成分值昂贵的原材料的保存。应注意，有机溶剂不能对活性成分 有影响。有影响。3.3.防腐剂保鲜。防腐剂保鲜。适应于液体原材料，如发酵液、提取液等。常适应于液体原材料，如发酵液、提取液等。常 用防腐剂有乙醇、苯酚、甘油等。用防腐剂有乙醇、苯酚、甘油等。二、目的产物的提取纯化二、目的产物的提取纯化（一）组织细胞破碎（一）组织细胞破碎 常用的方法：常用的方法：组织匀浆法、反复冻融、超声振荡、酶解组织匀浆法、反复冻融、超声振荡、酶解法、高压破碎、渗透压法、研磨法、高压破碎、渗透压法、研

5、磨等。等。 目的：目的：将目标分子以可溶态充分暴露出来，并与其他成将目标分子以可溶态充分暴露出来，并与其他成分分开，便于后续的高效率纯化。分分开，便于后续的高效率纯化。（二）固液分离（二）固液分离 方法：方法：离心、离心、膜过滤、自然沉降。膜过滤、自然沉降。 目的：目的：将细胞碎片或未充分破碎的组织等杂质去掉。将细胞碎片或未充分破碎的组织等杂质去掉。（三）目的产物的分离纯化（三）目的产物的分离纯化 除去可溶性杂质，同时富集目的产物的过程，称之为分除去可溶性杂质，同时富集目的产物的过程，称之为分离纯化。这是生物制品制备的核心。离纯化。这是生物制品制备的核心。 方法：方法：沉淀技术、离心技术、过（

6、超）滤技术、层析技术、沉淀技术、离心技术、过（超）滤技术、层析技术、萃取技术、电泳技术萃取技术、电泳技术等，是生物制品制备的常用技术。等，是生物制品制备的常用技术。 但应注意，但应注意，生物分子千差万别，生物分子千差万别，不同的目的产物，由于其不同的目的产物，由于其物理、化学性质不同，生物学特性迥异，因此没有一个方法适物理、化学性质不同，生物学特性迥异，因此没有一个方法适合于任何生物制品的分离纯化合于任何生物制品的分离纯化 工艺：工艺：制备某种生物制品的一系列技术方法的有机集成，制备某种生物制品的一系列技术方法的有机集成，称之为该生物制品的制备工艺。称之为该生物制品的制备工艺。 同样，同样，没

7、有一个工艺适合于所有生物制品的制备。有时，没有一个工艺适合于所有生物制品的制备。有时，同一种生物制品，在不同的实验室或车间也很难套用同一个生同一种生物制品，在不同的实验室或车间也很难套用同一个生产工艺；不同的操作者，使用同一个生产工艺，也很难达到同产工艺；不同的操作者，使用同一个生产工艺，也很难达到同样的生产效果。样的生产效果。第二节第二节 蛋白类生物制品的分离纯化方法蛋白类生物制品的分离纯化方法主要内容：主要内容：一、蛋白质的理化学性质一、蛋白质的理化学性质二、蛋白质提取、纯化的特点二、蛋白质提取、纯化的特点三、蛋白质提取、纯化前的准备三、蛋白质提取、纯化前的准备四、蛋白质提取、纯化的一般步

8、骤四、蛋白质提取、纯化的一般步骤五、重组五、重组蛋白质提取、纯化的一般步骤蛋白质提取、纯化的一般步骤一、蛋白质的理化性质一、蛋白质的理化性质共有以下共有以下7个性质：个性质：1. 1. 蛋白质的两性解离和等电点蛋白质的两性解离和等电点2. 2. 蛋白质的呈色反应蛋白质的呈色反应3. 3. 蛋白质的紫外吸收蛋白质的紫外吸收4. 4. 蛋白质的分子量蛋白质的分子量5. 5. 蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质6. 6. 蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀7. 7. 蛋白质的变性与复性蛋白质的变性与复性 当蛋白质溶液处于某一当蛋白质溶液处于某一pH值时，蛋白质解离成正、值时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，净

9、电荷为负离子的趋势相等，净电荷为“O”，此时溶液的，此时溶液的pH值值称为该蛋白质的等电点称为该蛋白质的等电点(isoelectric point, pI)。 蛋白质溶液的蛋白质溶液的pH大于等电点，该蛋白质颗粒带负大于等电点，该蛋白质颗粒带负电荷，反之则带正电荷。电荷，反之则带正电荷。 蛋白质分子所带电荷的性质决定了它在电场中移蛋白质分子所带电荷的性质决定了它在电场中移动的方向。处于等电点的蛋白质颗粒，在电场中并不动的方向。处于等电点的蛋白质颗粒，在电场中并不移动。移动。 人体体液中许多蛋白质的等电点在人体体液中许多蛋白质的等电点在pH5.0左右，所左右，所以在体液中以负离子形式存在。以在体

10、液中以负离子形式存在。（一）蛋白质的两性解离和等电点（一）蛋白质的两性解离和等电点（二）蛋白质的呈色反应（二）蛋白质的呈色反应 1. 茚三酮反应茚三酮反应(Ninhydrin Reaction) -氨基酸与水化茚三酮氨基酸与水化茚三酮(苯丙环三酮戊烃苯丙环三酮戊烃)作用时，产生蓝色作用时，产生蓝色反应。蛋白质是由许多反应。蛋白质是由许多-氨基酸组成的，故也呈此颜色反应。氨基酸组成的，故也呈此颜色反应。 2. 双缩脲反应双缩脲反应(Biuret Reaction) 蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用呈现紫红色，称为双缩脲蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用呈现紫红色，称为双缩脲反应。凡分子中含有两个以上反

11、应。凡分子中含有两个以上CONH键的化合物，都呈此键的化合物，都呈此反应。反应。 3. 米伦反应米伦反应(Millon Reaction) 蛋白质溶液中加入米伦试剂蛋白质溶液中加入米伦试剂(亚硝酸汞、硝酸汞及硝酸的混亚硝酸汞、硝酸汞及硝酸的混合液合液)，蛋白质首先沉淀，加热则变为红色沉淀。，蛋白质首先沉淀，加热则变为红色沉淀。 此外，蛋白质溶液还可与酚试剂、乙醛酸试剂、浓硝酸等发此外，蛋白质溶液还可与酚试剂、乙醛酸试剂、浓硝酸等发生颜色反应。生颜色反应。 （三）蛋白质的紫外吸收（三）蛋白质的紫外吸收 因为蛋白质中含有因为蛋白质中含有Tyr、Phe、Trp等芳香氨基酸，其紫等芳香氨基酸，其紫外吸

12、收最大峰的波长为外吸收最大峰的波长为280nm。而且光吸收值（。而且光吸收值（OD值）与蛋值）与蛋白质的浓度程正相关。白质的浓度程正相关。 测定蛋白质浓度的方法：标准曲线法和经验公式法。测定蛋白质浓度的方法：标准曲线法和经验公式法。标准曲线法标准曲线法:经验公式法：经验公式法： 蛋白质浓度（蛋白质浓度（mg/ml）= 1.45OD280-0.74OD260注意：注意：在使用该公式时，在使用该公式时，OD280 应在应在0.10.7之间，所测值才之间，所测值才 比较准确。比较准确。（四）蛋白质的分子量（四）蛋白质的分子量 蛋白质分子大小通常用道尔顿（蛋白质分子大小通常用道尔顿（Dalton，Da

13、）或千道尔顿）或千道尔顿（kDa）表示，一般在）表示，一般在6103106之间。之间。 测定蛋白质的分子量有许多方法，常用的有测定蛋白质的分子量有许多方法，常用的有SDS-聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝胶电泳（胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、凝胶过滤法等。这些方法的误差）、凝胶过滤法等。这些方法的误差为为5%10%。 Dalton: A unit of mass very nearly equal to that of a hydrogen atom. Named after John Dalton (17661844), who developed the atomic theory of matte

14、r.理论推算法：理论推算法：蛋白质分子量（蛋白质分子量（Da）= 氨基酸数目氨基酸数目110SDS-PAGE测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量蛋白质洗脱体积与分子量的关系蛋白质洗脱体积与分子量的关系分子筛层析示意图分子筛层析示意图 凝胶过滤法：凝胶过滤法： 又称分子筛层析法又称分子筛层析法 将几种已知分子量的蛋白质混合溶液上柱洗脱，记录各种蛋白质的洗脱将几种已知分子量的蛋白质混合溶液上柱洗脱，记录各种蛋白质的洗脱体积。以分子量的对数为纵坐标，以洗脱体积为横坐标，作标准曲线。体积。以分子量的对数为纵坐标，以洗脱体积为横坐标，作标准曲线。待测蛋白质溶液在上述相同的层析条件下分离，记录其洗脱体积，然后

15、待测蛋白质溶液在上述相同的层析条件下分离，记录其洗脱体积，然后根据标准曲线计算其分子量。根据标准曲线计算其分子量。 （五）蛋白质的胶体性质（五）蛋白质的胶体性质 根据溶质在溶剂中的颗粒大小（分散程度），可以把分散根据溶质在溶剂中的颗粒大小（分散程度），可以把分散系统分为系统分为3类：类： 分散相质点小于分散相质点小于1nm的为真溶液，大于的为真溶液，大于100nm的为悬浊液，的为悬浊液，介于介于l100nm的为胶体溶液。的为胶体溶液。 分散相质点在胶体系统中保持稳定，需具备分散相质点在胶体系统中保持稳定，需具备3个条件：个条件： 1）分散相质点大小在）分散相质点大小在l100nm范围内，这样大

16、小的质点在范围内，这样大小的质点在动力学上是稳定的，介质分子对这种质点碰撞的合力不等于零，动力学上是稳定的，介质分子对这种质点碰撞的合力不等于零，使它能在介质中不断作使它能在介质中不断作布朗运动布朗运动（Brown movement）；）； 2）分散相的质点带有）分散相的质点带有同种电荷，互相排斥同种电荷，互相排斥，不易聚集成大，不易聚集成大颗粒而沉淀；颗粒而沉淀； 3）分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层，例如与水形成）分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层，例如与水形成水水化层化层（hydration mantle），质点有了水化层，相互间不易靠拢），质点有了水化层，相互间不易靠拢而聚集。而聚集。

17、（六）蛋白质的沉淀（六）蛋白质的沉淀 蛋白质分子凝聚并从溶液中析出的现象，称为蛋白质沉蛋白质分子凝聚并从溶液中析出的现象，称为蛋白质沉淀淀(precipitation)。 变性蛋白质一般易于沉淀，但也可不变性而使蛋白质沉变性蛋白质一般易于沉淀，但也可不变性而使蛋白质沉淀，在一定条件下，变性的蛋白质也可不发生沉淀。淀，在一定条件下，变性的蛋白质也可不发生沉淀。 蛋白质所形成的亲水胶体颗粒具有三种稳定因素：颗粒蛋白质所形成的亲水胶体颗粒具有三种稳定因素：颗粒表面的水化层；电荷；布朗运动。表面的水化层；电荷；布朗运动。 除去前两个稳定因素除去前两个稳定因素(如调节溶液如调节溶液pH至等电点和加入脱水

18、至等电点和加入脱水剂剂)，蛋白质便容易凝集析出。，蛋白质便容易凝集析出。 1. 盐析盐析(Salting Out) 在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质的胶体在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出，这种方法称为盐析。常用的中性盐有硫稳定性而使其析出，这种方法称为盐析。常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等。酸铵、硫酸钠、氯化钠等。 2. 重金属盐沉淀蛋白质重金属盐沉淀蛋白质 蛋白质可以与重金属离子如汞、铅、铜、银等结合成盐蛋白质可以与重金属离子如汞、铅、铜、银等结合成盐沉淀，沉淀的条件以沉淀，沉淀的条件以pH稍大于等电点为宜。因为此时蛋白质稍大于等电点为宜。因为

19、此时蛋白质分子有较多的负离子，易与重金属离子结合成盐。分子有较多的负离子，易与重金属离子结合成盐。 3. 生物碱试剂以及某些酸类沉淀蛋白质生物碱试剂以及某些酸类沉淀蛋白质 蛋白质又可与生物碱试剂蛋白质又可与生物碱试剂(如苦味酸、钨酸、鞣酸如苦味酸、钨酸、鞣酸)以及某以及某些酸些酸(如三氯醋酸、过氯酸、硝酸如三氯醋酸、过氯酸、硝酸)结合成不溶性的盐沉淀，沉结合成不溶性的盐沉淀，沉淀的条件应当是淀的条件应当是pH小于等电点，这样蛋白质带正电荷，易于小于等电点，这样蛋白质带正电荷，易于与酸根负离子结合成盐。与酸根负离子结合成盐。常用的沉淀方法：常用的沉淀方法：4. 有机溶剂沉淀蛋白质有机溶剂沉淀蛋白

20、质 可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等，对水可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，在等电点时使的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，在等电点时使蛋白质沉淀。在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。蛋白质沉淀。在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。例如酒精消毒灭菌就是如此，但若在低温条件下，则变性进例如酒精消毒灭菌就是如此，但若在低温条件下，则变性进行较缓慢，可用于分离制备各种血浆蛋白质。行较缓慢，可用于分离制备各种血浆蛋白质。5. 加热凝固加热凝固 加热蛋白质溶液，可使蛋白质发生凝固加热蛋白质溶液，可使蛋白质发生凝固(coagu

21、lation)而而沉淀。沉淀。 加热首先是使蛋白质变性，有规则的空间结构被打开，加热首先是使蛋白质变性，有规则的空间结构被打开，呈松散状不规则的结构，分子的不对称性增加，疏水基团暴呈松散状不规则的结构，分子的不对称性增加，疏水基团暴露，进而凝聚成凝胶状的蛋白块。如煮熟的鸡蛋，蛋黄和蛋露，进而凝聚成凝胶状的蛋白块。如煮熟的鸡蛋，蛋黄和蛋清都凝固。清都凝固。 （七）蛋白质的变性与复性（七）蛋白质的变性与复性变性（变性（denaturation）：）： 在变性因素的作用下，蛋白质一级结构不发生变化，空在变性因素的作用下，蛋白质一级结构不发生变化，空间构象被破坏，生物学功能丧失，理化性质也发生改变的现

22、间构象被破坏，生物学功能丧失，理化性质也发生改变的现象。象。 变性蛋白质溶解度降低，粘度增加，结晶性被破坏，易变性蛋白质溶解度降低，粘度增加，结晶性被破坏，易发生沉淀。发生沉淀。复性（复性（Renaturation）: 在一定条件下，变性的蛋白质从伸展态恢复到折迭态，在一定条件下，变性的蛋白质从伸展态恢复到折迭态，并恢复其原来的理化性质和生物活性。并恢复其原来的理化性质和生物活性。 抗菌肽的提纯；抗菌肽的提纯；RNase A的配制的配制 与化学产品的分离制备相比较，蛋白质的制备有以下主要与化学产品的分离制备相比较，蛋白质的制备有以下主要特点：特点： 生物材料的生物材料的组成极其复杂组成极其复杂

23、。所以蛋白质分子的分离纯化。所以蛋白质分子的分离纯化方法差别极大，想找到一种适合各种蛋白质分子分离制备的标方法差别极大，想找到一种适合各种蛋白质分子分离制备的标准方法是不可能的。准方法是不可能的。 许多蛋白质分子在生物材料中的许多蛋白质分子在生物材料中的含量极微含量极微。 许多蛋白质分子一旦离开了生物体内的环境许多蛋白质分子一旦离开了生物体内的环境极易失活极易失活。 蛋白质的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、蛋白质的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断，因而实验结果常

24、有很大的估计和判断，因而实验结果常有很大的经验成份经验成份，实验，实验重复性重复性较差较差，个人的实验技术水平和经验对实验结果有较大的影响。，个人的实验技术水平和经验对实验结果有较大的影响。二、蛋白质提取、纯化的特点二、蛋白质提取、纯化的特点三、蛋白质提取、纯化前的准备蛋白质提取、纯化前的准备 在进行蛋白质的制备前，通常需要对以下几方面的内容加在进行蛋白质的制备前，通常需要对以下几方面的内容加以确定或预先了解。以确定或预先了解。 明确实验目的和要求。科研、开发，还是要发现新的物明确实验目的和要求。科研、开发，还是要发现新的物质。质。 通过文献调研和预备性实验，掌握目的蛋白质的理化性通过文献调研

25、和预备性实验，掌握目的蛋白质的理化性质和生物学特性。如质和生物学特性。如分子大小；溶解度；电荷；吸附性质；热分子大小；溶解度；电荷；吸附性质；热稳定性；对配体分子的生物学亲和力等。稳定性；对配体分子的生物学亲和力等。 建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备蛋白质的关建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备蛋白质的关键。键。 确定可能的技术路线和实验方案，这是最困难的过程，确定可能的技术路线和实验方案，这是最困难的过程，要求具有很高的综合知识和实验技术水平。要求具有很高的综合知识和实验技术水平。四、蛋白质提取、纯化的一般步骤四、蛋白质提取、纯化的一般步骤 1.1.选材：选材： 制备生物大分子，首先

26、要选择适当的生物材料。制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。 原则：原则：原材料来源充足；目标蛋白含量丰富；易于处理原材料来源充足；目标蛋白含量丰富；易于处理和提取。和提取。 2.2.生物材料的破碎和预处理：生物材料的破碎和预处理：常用的方法有组织匀浆法、常用的方法有组织匀浆法、研磨、反复冻融、溶菌酶、高压破碎等。研磨、反复冻融、溶菌酶、高压破碎等。 目的：目的：将目标蛋白以可溶态充分暴露出来，并与其他成将目标蛋白以可溶态充分暴露出来，并与其他成分分离。分分离。 3.3.粗分离：粗分离：将绝大多数杂质去掉的过程。方法多为离心、将绝大多数杂质去掉的过程。方法多为离心、盐析、有机溶剂沉淀、吸附

27、、等电点、超滤等。盐析、有机溶剂沉淀、吸附、等电点、超滤等。 4.4.纯化：纯化：将粗提物中的杂质进一步去除的过程，又称为精将粗提物中的杂质进一步去除的过程，又称为精制。方法为各种层析技术，特别是亲和层析技术。制。方法为各种层析技术，特别是亲和层析技术。 5.5.鉴定：鉴定：包括包括3 3方面的内容：含量；纯度；活性。贯穿于方面的内容：含量；纯度；活性。贯穿于提取、纯化的每一步。提取、纯化的每一步。 含量：含量：凯氏定氮法、凯氏定氮法、FolinFolin- -酚试剂法（酚试剂法（LowryLowry法）和紫外法）和紫外吸收法等。吸收法等。 纯度：纯度：生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定

28、，要生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLCHPLC和毛细管电和毛细管电泳都是一个峰。末端泳都是一个峰。末端AAAA测定。测定。 活性：活性：比活或生物活性鉴定。比活或生物活性鉴定。 6.6.产物的浓缩、干燥和保存产物的浓缩、干燥和保存。 与提取纯化天然蛋白质相比，重组蛋白质的提取纯化具与提取纯化天然蛋白质相比，重组蛋白质的提取纯化具有以下特点：有以下特点： 1.1. 细菌、酵母、传代细胞等表达体系组成背景清楚，细菌、酵母、传代细胞等表达体系组成背景清楚，用它们表达的重组蛋白的提取纯化简单、容易；用它们

29、表达的重组蛋白的提取纯化简单、容易； 2.2. 分泌表达的蛋白更易提取纯化，且不被细胞内蛋白分泌表达的蛋白更易提取纯化，且不被细胞内蛋白污染，特别是利用无血清培养时。污染，特别是利用无血清培养时。 3.3. 同一种蛋白质，应用不同的表达系统表达，其提取同一种蛋白质，应用不同的表达系统表达，其提取纯化的策略可能完全不同。纯化的策略可能完全不同。 4.4. 可根据可根据不同的表达系统特点，设计易于提取纯化目不同的表达系统特点，设计易于提取纯化目的蛋白的表达策略。的蛋白的表达策略。五、五、重组蛋白质重组蛋白质提取、纯化特点提取、纯化特点一般步骤：一般步骤： 1. 1. 细胞（菌体）与培养基的分离。细

30、胞（菌体）与培养基的分离。常用离心法（大量生常用离心法（大量生产可用连续离心机）。根据目的蛋白存在的部位，收集细胞产可用连续离心机）。根据目的蛋白存在的部位，收集细胞或培养基。或培养基。 2. 2. 细胞破碎。细胞破碎。常用的方法有超声破碎、高压破碎和反复常用的方法有超声破碎、高压破碎和反复冻融等。冻融等。目的：目的：将目标蛋白以可溶态充分暴露出来，并与其将目标蛋白以可溶态充分暴露出来，并与其他成分分离。他成分分离。若为分泌表达，本步骤可省略。若为分泌表达，本步骤可省略。 3. 3. 粗提。粗提。将绝大多数杂质去掉的过程。方法多为离心、将绝大多数杂质去掉的过程。方法多为离心、盐析、有机溶剂沉淀

31、、吸附、等电点、超滤等。盐析、有机溶剂沉淀、吸附、等电点、超滤等。 4.4.精制：精制：将粗提物中的杂质进一步去除。方法主要为各种层将粗提物中的杂质进一步去除。方法主要为各种层析技术，特别是亲和层析技术。析技术，特别是亲和层析技术。 基因工程包涵体在纯化前，需要可逆性的变性、复性处理。基因工程包涵体在纯化前，需要可逆性的变性、复性处理。 5. 5. 鉴定：鉴定：包括包括3 3方面的内容：含量；纯度；活性。贯穿于提方面的内容：含量；纯度；活性。贯穿于提取、纯化的每一步。取、纯化的每一步。 含量：含量：凯氏定氮法、凯氏定氮法、FolinFolin- -酚法（酚法（LowryLowry法）和紫外吸收

32、法法）和紫外吸收法等。等。 纯度：纯度：生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定。要求：生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定。要求：一维电泳一条带，二维电泳一个点，或一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLCHPLC和毛细管电泳都是一和毛细管电泳都是一个峰。末端氨基酸测定。个峰。末端氨基酸测定。 活性：活性：比活或生物活性鉴定。比活或生物活性鉴定。 6. 6. 产物的浓缩、干燥和保存产物的浓缩、干燥和保存。注意事项：注意事项： 防止目的蛋白的降解是关键。措施如下：防止目的蛋白的降解是关键。措施如下： 1.1.对宿主细胞或目的蛋白进行基因操作，防止蛋白水解。对宿主细胞或目的蛋白进行基因操作，

33、防止蛋白水解。如利用蛋白酶缺失的宿主菌或细胞；融合表达等。如利用蛋白酶缺失的宿主菌或细胞；融合表达等。 2.2.从重组蛋白溶液中除去蛋白酶。从重组蛋白溶液中除去蛋白酶。 3.3.抑制蛋白酶活性。如抑制剂（抑制蛋白酶活性。如抑制剂（EDTAEDTA、PMSFPMSF），降低操），降低操作温度等。作温度等。 4.4.迅速将表达的目的蛋白脱离表达体系。迅速将表达的目的蛋白脱离表达体系。 注意：注意：应同时联合应用几种方法。应同时联合应用几种方法。附：附：蛋白质含量测定技术蛋白质含量测定技术蛋白质含量（纯度）测定技术蛋白质含量（纯度）测定技术 蛋白质定量测定技术是生物化学研究中最常用、最基本的蛋白质定

34、量测定技术是生物化学研究中最常用、最基本的分析技术之一。蛋白质定量测定的方法很多，基本上都是根据分析技术之一。蛋白质定量测定的方法很多，基本上都是根据蛋白质的物理、化学或生物学特性建立的。蛋白质的物理、化学或生物学特性建立的。 目前，常用的方法有：目前，常用的方法有：定氮法，比色法（定氮法，比色法（Folin酚试剂法酚试剂法(Lowry法）、考马斯亮蓝法（法）、考马斯亮蓝法（Bradford法）、紫外吸收法和双法）、紫外吸收法和双缩脲法缩脲法(Biuret法法)。其中其中Lowry法和法和Bradford法灵敏度最高，比法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏紫外吸收法灵敏1020倍，比倍，比Biure

35、t法灵敏法灵敏100倍以上。定氮法倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。他方法的标准蛋白质。微量凯氏（微量凯氏（KjeldahlKjeldahl）定氮法）定氮法 蛋白质的元素组成中，氮的含量较为恒定，平蛋白质的元素组成中，氮的含量较为恒定，平均为均为1616，即即1g1g氮相当于氮相当于6.25g6.25g蛋白质。而生物样蛋白质。而生物样品中非蛋白含氮化合物的量通常较小，故只要从生品中非蛋白含氮化合物的量通常较小，故只要从生物样品中测定出总含氮量减去非蛋白含氮量，即可物样品中测定出总含氮量减

36、去非蛋白含氮量，即可推算出样品中蛋白质含量。定氮法比较复杂，但较推算出样品中蛋白质含量。定氮法比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。标准蛋白质。实验原理实验原理: : 样品与浓硫酸共热，含氮有机物即分解产生氨；样品与浓硫酸共热，含氮有机物即分解产生氨；氨与硫酸作用，变成硫酸氨；经强碱碱化又分解释氨与硫酸作用，变成硫酸氨；经强碱碱化又分解释放氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和放氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。的程度可计算得样品之氮含量。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品

37、中计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白氮含量，须将总氮量减去非蛋白氮。蛋白氮含量，须将总氮量减去非蛋白氮。 样品中蛋白质的含量，用样品中蛋白氮含量样品中蛋白质的含量，用样品中蛋白氮含量 6.25即得。即得。双缩脲法（双缩脲法（BiuretBiuret法）：法）： 实验借助于蛋白质分子中肽键与双缩脲试剂特殊实验借助于蛋白质分子中肽键与双缩脲试剂特殊的颜色反应，通过分光光度计测定待测蛋白质在的颜色反应，通过分光光度计测定待测蛋白质在540 nm处的光密度值（处的光密度值（OD540） 。 以已知标准蛋白的光密度值为纵坐标，标准蛋白以已知标准蛋白的光密度值为纵坐标，标准蛋白浓度为横坐标制作浓

38、度浓度为横坐标制作浓度-光密度标准曲线，利用该标准光密度标准曲线，利用该标准曲线法求出待测蛋白质含量。曲线法求出待测蛋白质含量。实验原理：实验原理： 双缩脲（双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经）是两个分子脲经180左右左右加热，放出一分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲加热，放出一分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个以上肽键的化合物都有双缩脲反应。基或两个以上肽键的化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质紫色络合物颜色的深

39、浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为围为110mg/mL蛋白质溶液。干扰这一测定的物质主要有：硫蛋白质溶液。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。缓冲液和某些氨基酸等。紫色络合物紫色络合物FolinFolin酚法（酚法（LowryLowry法）法） 此法是在双缩脲反应的基础上发展起来的，此法是在双缩脲反应的基础上发展起来的，Folin酚试剂法最早由酚试剂法最早由Lowry建立，是最灵敏的测定建立，是最灵敏的测定方法之一。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，

40、方法之一。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即只是加入了第二种试剂，即Folin酚试剂，以增加酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。方法的灵显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。方法的灵敏度好于双缩脲法，是目前教学、科研常用的蛋白质敏度好于双缩脲法，是目前教学、科研常用的蛋白质含量测定方法。含量测定方法。 用用Folin酚试剂和未知蛋白质反应产生蓝色反酚试剂和未知蛋白质反应产生蓝色反应，通过分光光度计测定其在应，通过分光光度计测定其在700nm处的光密度值，处的光密度值，以已知标准蛋白的光密度值为纵坐标，标准蛋白浓度以已知标准蛋白的光密度值为纵坐标，标准蛋

41、白浓度为横坐标制作浓度为横坐标制作浓度-光密度标准曲线，利用该标准曲光密度标准曲线，利用该标准曲线法求出待测蛋白质含量。线法求出待测蛋白质含量。实验原理：实验原理： 显色反应产生深兰色的原因是：显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物，并使肽链展蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物，并使肽链展开，其中的酪氨酸和色氨酸残基充分暴露出来；开，其中的酪氨酸和色氨酸残基充分暴露出来；Folin酚试剂中的磷钼酸盐酚试剂中的磷钼酸盐磷钨酸盐被蛋白质磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰中的酪氨酸和色氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合

42、物）。在一定的条件下，兰色的深浅和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色的深浅与蛋白质的含量成正比。与蛋白质的含量成正比。 本方法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，本方法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，可检测的最低蛋白质量达可检测的最低蛋白质量达5 g，通常测定范围是，通常测定范围是20250 g。考马斯亮兰法（考马斯亮兰法（BradfordBradford法）法） 由由Bradford在在1976年建立的考马斯亮兰法，又称年建立的考马斯亮兰法，又称Bradford法，是根据蛋白质与染料相结合的原理设计法，是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出

43、的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。但此法所优点，是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。但此法所用样品不能回收，不适合需回收样品蛋白的浓度测定。用样品不能回收，不适合需回收样品蛋白的浓度测定。但此法所用样品量较少，在生产和科研中仍然较多使但此法所用样品量较少，在生产和科研中仍然较多使用。用。实验原理：实验原理： 考马斯亮兰考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白染料，在酸性溶液中与蛋白质通过范德华引力结合，使染料的最大吸收峰的位质通过范德华引力结合，使染料的最大吸收峰的位置（置（ max）由）由455nm变为变为595nm，溶液的颜色也由，溶液的颜

44、色也由棕黑色变为兰色。在一定蛋白质浓度范围内，蛋白棕黑色变为兰色。在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质的颜色符合比尔定律，与蛋白质浓度成正比。质的颜色符合比尔定律，与蛋白质浓度成正比。 干扰此法测定的主要物质有：去污剂、干扰此法测定的主要物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（、十二烷基硫酸钠（SDS）和）和0.1mol/L的的NaOH。紫外分光光度法：紫外分光光度法： 利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱层析分

45、离在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱层析分离中）广泛应用。中）广泛应用。实验原理：实验原理： 蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在质，吸收高峰在280nm处。在该波长附近，吸光度处。在该波长附近，吸光度（OD值）与蛋白质含量（值）与蛋白质含量（0.1mg/ml1.0mg/ml）成正）成正比。根据这一特性，可以进行蛋白质含量的测定。比。根据这一特性，可以进行蛋白质含量的测定。第三节第三节 核酸类生物制品的核酸类生物制品的分离纯化方法分离纯化方

46、法 核酸核酸(DNA(DNA或或RNA)RNA)经水解可得到很多核苷酸，因此核苷经水解可得到很多核苷酸，因此核苷酸是核酸的基本结构单位。酸是核酸的基本结构单位。 核酸是由很多单核苷酸聚合形成的长链大分子核酸是由很多单核苷酸聚合形成的长链大分子( (多聚核多聚核苷酸苷酸) )。 核酸是生物体的基本组成物质，是重要的生物大分子之一！核酸是生物体的基本组成物质，是重要的生物大分子之一！ 原核原核细胞的染色体细胞的染色体DNADNA基本呈裸露状态，存在于类基本呈裸露状态，存在于类核区。核区。 质粒质粒（plasmidplasmid）是一种独立于染色体之外、能够）是一种独立于染色体之外、能够自主复制的双

47、链环状自主复制的双链环状DNADNA。 真核真核细胞中细胞中, , DNADNA主要存在于核内的染色体上，与主要存在于核内的染色体上，与组蛋白结合，以核蛋白体的形式存在；线粒体、叶绿组蛋白结合，以核蛋白体的形式存在；线粒体、叶绿体中亦存在少量体中亦存在少量DNADNA。 RNARNA（mRNAmRNA、tRNAtRNA、rRNArRNA）主要存在于细胞质中，）主要存在于细胞质中，也以核蛋白体的形式存在。也以核蛋白体的形式存在。 生物细胞中的核酸种类、存在部位：生物细胞中的核酸种类、存在部位：DNA的性质的性质1. 1. 溶解性：溶解性：微溶于水，不溶于有机溶剂。微溶于水，不溶于有机溶剂。2.

48、2. 粘性：粘性：无分支，线或环状；分子很长，在溶液中呈粘稠状。无分支，线或环状；分子很长，在溶液中呈粘稠状。3. 3. 刚性：刚性：双螺旋结构具有刚性，受剪切力的作用，易断裂。双螺旋结构具有刚性，受剪切力的作用，易断裂。4. 4. 易降解：易降解：溶液中的溶液中的DNADNA易被核酸酶降解。易被核酸酶降解。5. 5. 变性变性/ /复性：复性：具有变性和复性现象（增色具有变性和复性现象（增色/ /减色效应）。减色效应）。6. 6. 内切酶识别和切割：内切酶识别和切割：被被型型限制性内切酶识别和切割。具有限制性内切酶识别和切割。具有 特异性。特异性。DNADNA制备的原理：制备的原理：1.1.

49、 DNA DNA蛋白和蛋白和RNARNA蛋白在不同的盐溶液中的溶解度不同。蛋白在不同的盐溶液中的溶解度不同。2.2. 蛋白质的变性。蛋白质的变性。3.3. DNA DNA不溶于有机溶剂。不溶于有机溶剂。 例如：例如：在稀盐溶液中，核糖核蛋白的溶解度大于脱氧核糖在稀盐溶液中，核糖核蛋白的溶解度大于脱氧核糖核蛋白；在浓盐溶液中，则反之。据此，调整盐浓度即可把这核蛋白；在浓盐溶液中，则反之。据此，调整盐浓度即可把这两种核蛋白体分开两种核蛋白体分开 分离得到的脱氧核糖核蛋白，用十二烷基硫酸钠（分离得到的脱氧核糖核蛋白，用十二烷基硫酸钠（SDS）使蛋白质成分变性，让使蛋白质成分变性，让DNA游离出来，再

50、用氯仿沉淀除去变性游离出来，再用氯仿沉淀除去变性蛋白质。蛋白质。 最后根据核酸只溶于水而不溶于有机溶剂的特点，加入无最后根据核酸只溶于水而不溶于有机溶剂的特点，加入无水乙醇，即可从除去蛋白质的溶液中把水乙醇，即可从除去蛋白质的溶液中把DNA沉淀出来，获得沉淀出来，获得DNA纯品。纯品。乙醇沉淀乙醇沉淀核蛋白体核蛋白体DNA核蛋白核蛋白RNA核蛋白核蛋白DNADNA纯品纯品蛋白质蛋白质SDS稀盐溶液稀盐溶液细胞破碎细胞破碎 1. 抑制核酸酶活性，防止核酸降解。抑制核酸酶活性，防止核酸降解。DNA或或RNA的制备，最的制备，最主要的应防止核酸酶的降解，主要方法如下：主要的应防止核酸酶的降解，主要方

51、法如下： 1）低温操作）低温操作(冰水冰水)。 2）加入柠礞酸溶液）加入柠礞酸溶液(与与Mg2+结合，形成络合物，降低核酸结合，形成络合物，降低核酸酶活性酶活性)。 3）加入）加入SDS使酶变性。使酶变性。 4）RNA酶抑制剂。酶抑制剂。2. 应尽可能保持应尽可能保持DNA的完整性。防止剪切力作用，使的完整性。防止剪切力作用，使DNA断断 裂，动作须轻缓。裂，动作须轻缓。注意事项：注意事项：第四节第四节 基因工程制品的制备基因工程制品的制备主要内容：主要内容：1.1. 什么是什么是基因工程和基因工程和基因工程制品？基因工程制品？2.2. 获得目的获得目的DNADNA基因的方法有哪些？基因的方法

52、有哪些？3.3. DNADNA双脱氧测序技术的基本原理；双脱氧测序技术的基本原理；4.4. PCRPCR技术的基本原理及其应用；技术的基本原理及其应用；5.5. 核酸杂交技术的基本原理与应用。核酸杂交技术的基本原理与应用。 本义：本义：根据人们的意愿，利用工程设计的方法，在体外根据人们的意愿，利用工程设计的方法，在体外将克隆获得的目的基因与适当的载体进行切割和连接，构建将克隆获得的目的基因与适当的载体进行切割和连接，构建成正确的重组表达载体，再应用物理的、化学的或生物学的成正确的重组表达载体，再应用物理的、化学的或生物学的方法将该表达载体导入到细菌、动植物细胞或受精卵中，使方法将该表达载体导入

53、到细菌、动植物细胞或受精卵中，使目的基因在细胞或宿主体内以瞬时方式或稳定方式进行表达，目的基因在细胞或宿主体内以瞬时方式或稳定方式进行表达，借此研究目的基因的结构与功能，或获得该基因的表达产物。借此研究目的基因的结构与功能，或获得该基因的表达产物。这一过程就是基因工程。这一过程就是基因工程。 广义：广义：转基因动物；克隆；基因打靶；基因组计划等均转基因动物；克隆；基因打靶；基因组计划等均属于基因工程的范畴。属于基因工程的范畴。一、基因工程和基因工程制品的定义一、基因工程和基因工程制品的定义基因工程：基因工程：基因工程制品：基因工程制品： 利用基因工程的手段，将目的基因在适当的宿利用基因工程的手

54、段，将目的基因在适当的宿主细胞或动、植物体内高效表达，经提取纯化和鉴主细胞或动、植物体内高效表达，经提取纯化和鉴定后，所获得的目的基因的表达产物，即为基因工定后，所获得的目的基因的表达产物，即为基因工程制品。程制品。目的基因获得目的基因获得表达载体构建表达载体构建基因的导入基因的导入整合与表达的鉴定整合与表达的鉴定表达产物的提取、纯化与鉴定表达产物的提取、纯化与鉴定二、基因工程的基本步骤二、基因工程的基本步骤上游技术上游技术下游技术下游技术三、基因工程中的基本方法三、基因工程中的基本方法（一）核酸的提取纯化（一）核酸的提取纯化 1. DNA提取纯化技术；提取纯化技术； 2. plasmid提取

55、纯化技术；提取纯化技术； 3. mRNA提取纯化技术。提取纯化技术。（二）核酸电泳技术（二）核酸电泳技术 1. 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 2. SDS-PAGE核酸电泳技术核酸电泳技术 1. 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 2. SDS-PAGE 500200010007501002001 DL2000 marker1 DL2000 marker2 BamHI2 BamHI和和EcoRIEcoRI双切双切3 BamHI3 BamHI单切单切4 Hind4 Hind单切单切5 5 重组质粒重组质粒pVAX1/ABPS1pVAX1/ABPS1 1 2 3 4 5真核细胞总真核细胞总RNA的电泳结

56、果：的电泳结果：（三）（三）DNADNA双脱氧测序双脱氧测序（四）核酸杂交技术（四）核酸杂交技术（probe） 1）原理；原理； 2）标记物；标记物； 3）种类；种类； 4）应用应用 1. Dot blot2. Southern blot： DNA（五）（五）PCRPCR技术技术 1.1.基本原理基本原理 2.2.引物设计引物设计 1)1)长度长度; 2)GC%; ; 2)GC%; 3)stem-loop; 4)dimer; 3)stem-loop; 4)dimer; 5) 5)错配错配; ; 6)5 6)5末端可以不配对。末端可以不配对。 3.3.应用应用: : 科学研究；医学与兽医临床。科

57、学研究；医学与兽医临床。Kary B. MullisLa Jolla, CA, USA. B.1944DNADNA生物合成与生物合成与PCRPCR方法合成方法合成DNADNA的异同点的异同点: :1.1.相同点：相同点：均为酶促反应；均需要模板和引物；底物为均为酶促反应；均需要模板和引物；底物为dNTP； 半保留复制；均为半保留复制；均为5 3方向复制。方向复制。2.2.不同点：不同点：1）反应条件不同：体内为生理条件，体外为反应条件不同：体内为生理条件，体外为94、52及及72 等变温条件；等变温条件；2）参与反应的物质种类和数量不同；参与反应的物质种类和数量不同；3 3）引物不同，体内为引

58、物不同，体内为RNARNA，体外为，体外为DNADNA，且在，且在DNADNA合成后，前者合成后，前者 被切除掉，后者作为终产物的一部分；被切除掉，后者作为终产物的一部分；4 4）体内为半不连续合成，体外为连续合成；体内为半不连续合成，体外为连续合成；5 5）体内单复制原点或多复制原点，单方向或双方向复制；体内单复制原点或多复制原点，单方向或双方向复制；6 6）体内受细胞周期的调控，体外按人们的意愿进行；体内受细胞周期的调控，体外按人们的意愿进行；7 7）体内具有校正、修复的功能（错配率较低），体外无（错配体内具有校正、修复的功能（错配率较低），体外无（错配 率较高）；率较高）；8 8）体内体

59、内DNADNA的复制为全部染色体的复制为全部染色体DNADNA的复制，体外仅复制两引物的复制，体外仅复制两引物 之间的之间的DNADNA序列。序列。四、基因工程中的工具四、基因工程中的工具 （一）载体（一）载体 1.1.质粒质粒( (plasmidplasmid) ) 2.2.粘粒粘粒( (cosmidcosmid) ) 3.3.phagephage或其他病毒，如腺病毒、杆状病毒等。或其他病毒，如腺病毒、杆状病毒等。 （二）工具酶（二）工具酶 1.1.限制性内切酶限制性内切酶 2.2.外切酶外切酶 3.3.连接酶连接酶 4.4.聚合酶聚合酶: klenow: klenow I I 5. 5.核

60、酸酶核酸酶 （三）宿主菌：（三）宿主菌： DH5 , JM101, JM109, DE3等。等。五、获得目的基因的方法五、获得目的基因的方法 基因文库：基因文库：基因组文库和基因组文库和cDNA文库；文库； PCR； 化学合成。化学合成。 还有还有DD-PCR以及以及基因芯片基因芯片等技术。等技术。应对获得的目的基因进行测序鉴定！应对获得的目的基因进行测序鉴定！六、重组质粒（表达载体）的构建与鉴定六、重组质粒（表达载体）的构建与鉴定1. DNA（载体和目的片段）的酶切与回收。（载体和目的片段）的酶切与回收。2. 目的片段与载体的连接。二者的摩尔比应满足以下目的片段与载体的连接。二者的摩尔比应满