多聚酶链式反应扩增DNA

1、 课题课题2多聚酶链式反应扩增多聚酶链式反应扩增DNA片段片段l知识回顾：知识回顾：l1.DNA分子的结构（外侧、内侧、基本单位）；分子的结构（外侧、内侧、基本单位）；2. DNA复制过程和特点；复制过程和特点；l3.PCR技术概念及应用。技术概念及应用。l基本概念：变性、复性、基本概念：变性、复性、Taq DNA聚合酶、引物聚合酶、引物l理解理解PCR技术的原理技术的原理l掌握掌握PCR技术的全过程技术的全过程l比较比较PCR技术和体内技术和体内DNA复制的异同点。复制的异同点。1、DNA分子的分子的3 端与端与5 端端-OH端为端为3 ; 磷酸基团的末端为磷酸基团的末端为5 。2、DNA分

2、子由两条分子由两条反向平行反向平行的脱氧核苷的脱氧核苷酸链根据酸链根据碱基互补配对原则碱基互补配对原则形成形成氢键氢键连接连接而成。而成。解旋酶解旋酶DNA母链母链4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸DNA聚合酶聚合酶引物（引物（ RNA）打开打开DNA双链双链模板模板合成子链原料合成子链原料催化子链合成催化子链合成使使DNA聚合酶能从聚合酶能从引物引物3端开始连接端开始连接脱氧核苷酸脱氧核苷酸 思考：思考：3、是什么？是什么？ 体外扩增体外扩增DNA 如何提供相似环境？如何提供相似环境？ 变性（变性（ 80-100 ）Taq聚合酶（耐高温）聚合酶（耐高温）1530个核苷酸构个核苷酸构成成DNA或或RN

3、ADNA双链双链单链单链变性（加热变性（加热80-100 ）复性（缓慢冷却）复性（缓慢冷却）4、DNA 分子的热变性原理：分子的热变性原理：变性的目的：变性的目的：复性的目的：复性的目的：解开双链解开双链有利于引物有利于引物和引物和引物与两条单与两条单链的结合链的结合l利用利用DNA分子的分子的热变性热变性原理，通过控原理，通过控 制制温度温度来控制双链的来控制双链的解聚解聚与与结合，结合，从而从而完成完成体外体外DAN分子的扩增分子的扩增。l体外体外DNA复制的条件：复制的条件： 四种脱氧核苷四种脱氧核苷酸、耐高温的聚合酶、引物、酸、耐高温的聚合酶、引物、 模板；缓模板；缓冲溶液和严格控制温

4、度的温控设备。冲溶液和严格控制温度的温控设备。l复制的方向：复制的方向：子链的子链的5 端向端向 3端延伸。端延伸。每个循环包括：每个循环包括：变性变性 复性复性延伸延伸 从第二轮循环开始，上一次循环的从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且产物也可以作为模板参与反应，并且由由引物引物延伸而成的延伸而成的DNADNA单链会与引物单链会与引物结合，进行结合，进行DNADNA的延伸，的延伸，这样，这样，DNADNA聚合聚合酶只能特异性地复制酶只能特异性地复制处于两个引物之间处于两个引物之间的的DNADNA序列序列，使这段固定长度的序列，使这段固定长度的序列呈呈指数扩增指数扩增

5、。准备准备好好PCR反应体系的配方反应体系的配方用微量用微量移液移液器按配方在往微量器按配方在往微量离心管中加入各组分离心管中加入各组分盖严盖子，用手指轻轻弹击盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁管壁混合混合反应液反应液离心离心10分钟分钟将离心管放入将离心管放入PCR仪上，设置好仪上，设置好循环程序进行循环程序进行反应反应四、结果分析与评价四、结果分析与评价DNA 含量的测定：稀释含量的测定：稀释对照调零对照调零测定测定计算（公式见计算（公式见P63）波长波长260nm处读数处读数蒸馏水蒸馏水做对照做对照50倍倍PCRPCR技术与体内技术与体内DNADNA复制的区别：复制的区别： 1. PCR 1.

6、 PCR不需要解旋酶；体内不需要解旋酶；体内DNADNA复制复制需要；需要； 2. PCR 2. PCR需要耐热的需要耐热的DNADNA聚合酶（常用聚合酶（常用TaqDNATaqDNA聚合酶），而生物体内的聚合聚合酶），而生物体内的聚合酶在高温时会变性；酶在高温时会变性； 3. PCR 3. PCR一般要经历三十多次循环，而一般要经历三十多次循环，而生物体内生物体内DNADNA复制需要生物体自身的复复制需要生物体自身的复制。制。 练习巩固练习巩固1、关于、关于PCR技术的应用，错误的一项是技术的应用，错误的一项是A 古生物学、刑侦破案、古生物学、刑侦破案、DNA序列测定序列测定B 诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学C DNA序列测定、基因克隆、刑侦破案序列测定、基因克隆、刑侦破案D 诊断遗传疾病、合成核苷酸、诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列测定序列测定2、DNA的合成方向总是从子链的哪一端向的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延伸？哪一端延伸？3、PCR技术最突出的优点是技术最突出的优点是A 原理简单原理简单 B 原料易找原料易找C TaqDNA聚合酶有耐热性聚合酶有耐热性D 快速、高效、灵活、易于操作快速、高效、灵活、易于操作4、做、做PCR使用的微量离