核磁共振在多糖结构研究中的应用

1、核磁共振在多糖结构研究中的应用主要内容主要内容一、一、核磁共振谱的基本内容三、三、核磁共振在多糖结构的应用二、 单糖的基础知识第1页/共39页核磁共振的基本内容核磁共振的基本内容第2页/共39页核磁共振的基本知识核磁共振的基本知识： 它表示的是在所有的带电荷的原子核中，核电荷绕轴自旋，我们就把这种自旋电荷运动的状态称之为自旋量子数。 在原子核中，I 是每个质子和中子各自的自旋的合量。 若自旋量子数总和为偶数时，I为零或整数；若总和为奇数时，I 为半整数；如质子和中子的总和均为偶数时，则I为零。 I为零时，原子核不具有磁性，所以在核磁共振中不能给出NMR信号。(如:12C 160 等）I0时，原

2、子核在自旋中会产生磁偶矩而具有磁性。第3页/共39页同位素I天然丰度（%）u绝对灵敏度共振频率（MHz)/B=7.0463T1H1/299.982.791.003002H10.0150.861.45*10-646.0513C1/21.110.701.76*10-475.4314N199.630.401.01*10-321.6715N1/20.37-0.283.85*10-630.4019F1/21002.630.83282.2331P1/21001.136.63*10-2121.40一些磁核的性质一些磁核的性质第4页/共39页核磁共振的基本概念核磁共振的基本概念1、是一种吸收光谱2、样品（溶液

3、状态）置于强磁场中（1-12 Tesler)3、射频电子波（波长=110Mum）照射4、具有磁性原子核产生核能级跃迁而引起电子波的吸收核磁共振第5页/共39页核磁共振仪核磁共振仪 一个能产生均匀磁场的强磁铁，并用绕在磁铁上的扫描线圈使磁场强度在一个相当窄的范围内连续地、精确的改变。 射频振荡器 目前常采用400MHz 或500MHz的电磁波，还有更高的600MHz、900MHz。 射频接受器 核磁产生共振时，能检出被吸收的电磁波能量。 记录仪和积分器 能把弱信号累加并记录下来。 样品管座：它规定了样品相对于外加磁场、发射线圈和接收线圈之间的位置。它能够一定的速度旋转，使样品受到均匀磁场作用。

4、另外还有去偶仪、计算机、温度可变装置和异核射频振荡器等第6页/共39页核磁共振的常用术语核磁共振的常用术语第7页/共39页化学位移概念：表示不同质子的信号差别的物理量。它是以某种标准物质的共振峰（如：TMS)为原点，测出各峰与原点的距离，此距离就称化学位移。左边的峰为正，右边的峰为负。 （原因：分子中处于不同化学环境中的核，由于其外围电子云分布情况各不相同，因而产生不同程度的屏蔽效应，因此就会存在略有区别的共振频率。） 2 2、表示方法： 单位（ppm)由于化学位移的大小与核所处的化学环境有密切关系，因此就有可能根据化学位移的大小来了解核所处的化学环境，即了解有机化合物的分子结构。 同一个物质

5、在不同规格型号的仪器上所测得的数值是相同的。第8页/共39页内标物在化学位移测定时，常用的标准物是四甲基硅烷（CH3)4Si，简称 TMS。TMS 用作标准物质的优点是：1.TMS 化学性质不活泼，与样品之间不发生化学反应和分子间缔合；2.TMS 是一个对称结构，四个甲基有相同的化学环境，因此无论在氢谱还是在碳谱中都只有一个吸收峰；3.因为 Si的电负性（1.9）比 C 的电负性（2.5）小，TMS 中的氢核和碳核处在高电子密度区，产生大的屏蔽效应，它产生 NMR 信号所需的磁场强度比一般有机物中的氢核和碳核产生 NMR 信号所需的磁场强度都大得多，与绝大部分样品信号之间不会互相重叠干扰；4.

6、TMS 沸点很低（27度），容易去除，有利于回收样品。5.但 TMS 是非极性溶剂，不溶于水。对于那些强极性试样，必须用重水为溶剂测谱时要用其它标准物。第9页/共39页自旋-自旋偶合：耦合是裂分的原因，裂分是耦合的结果。：CHCH21 偕偶：间隔两个单键的偶合称偕偶,即：同碳原子上的H之间偶合。表示为： 其范围为1016 Hz 2 邻偶：间隔三个键的偶合，称邻偶， 3J其范围为59 Hz 3 远程偶合：通常大于三个键间隔时，J值小于1，常常看不见偶合作用，但是在 体系中存在。第10页/共39页测试NMR的溶剂 NMR溶剂的选择：不产生干扰信号、溶解性能好、沸点低、与被测样品不发生化学反应。N

7、M R s o l v e n t s i g n a l s S o l v e n t (1H ) (1 3C ) ( H O D o r D2O ) A c e t o n e 2 .0 5 ( 5 ) 2 0 6 .7 ( 1 3 ) , 2 9 .9 ( 7 ) 2 .8 A c e t o n i t r i l e 1 .9 4 ( 5 ) 1 1 8 .7 ( 1 ) , 1 .3 9 ( 7 ) 2 .1 B e n z e n e 7 .1 6 ( 1 ) 1 2 8 .4 ( 3 ) 0 .4 C h l o r o f o r m 7 .2 6 ( 1 ) 7 7 .2

8、 ( 3 ) 1 .6 D M S O 2 .5 0 ( 5 ) 3 9 .5 ( 7 ) 3 .3 M e t h a n o l 3 .3 1 ( 5 ) 4 9 .1 ( 7 ) 4 .8 C D2C l2 5 .3 2 ( 3 ) 5 4 .0 0 ( 5 ) 1 .5 P y r i d i n e 8 .7 4 ( 1 ) , 7 .5 8 ( 1 ) , 7 .2 2 ( 1 ) 1 5 0 .3 ( 1 ) , 1 3 5 .9 ( 3 ) , 1 2 3 .9 ( 5 ) 4 .9 W a t e r ( D2O ) 4 .8 4 .8 第11页/共39页单糖的结构基础知识

9、糖的表示式CH2OHCHOCHOCH3CHOCH2OHOCHOCH2OHD-木糖L-鼠李糖D-葡萄糖D-果糖五碳醛糖甲基五碳醛糖六碳醛糖六碳酮糖 单糖是多羟基醛或酮。从三碳糖至八碳糖天然界都有存在。每个糖都有两个以上的手性碳原子，它们的命名规则是：碳原子的排列顺序是从醛基或者酮基基团为C-1开始的。CHOCH2OHOD-葡萄糖单糖在水溶液中形成半缩醛环状结构，即成呋喃糖和吡喃糖。具有六元环结构的糖吡喃糖（pyranose）具有五元环结构的糖呋喃糖（furanose）糖处游离状态时用Fischer式表示，苷化后成环用Haworth式表示第12页/共39页单糖的结构基础知识 醛糖和酮糖甘油醛和二羟

10、基丙酮有相同的化学组成，C3H6O3，但是不同的结构，它们属于结构异构体。CCHOHCH2OHOHG ly c e r a ld e h y d e(a n a ld o s e )C3H6O3CH2OHCCH2OHD ih y d r o x y a c e to n e(a n k e to s e )C3H6O3OCCC H2O HHOO HHCCC H2O HHOHH Om irror planL - glyceraldehydeD - glyceraldehyde甘油醛有一个不对成碳原子（手性碳原子），所以它有两个立体异构体，即D-和L-型。并且互为镜像异构体。第13页/共39页单糖

11、的结构基础知识 Fischer与Haworth的转换及其相对构型 C H OC H2O HOOCC H2O HHOHOCC H2O HO HHOD - 葡 萄 糖异 侧同 侧异 侧同 侧 单糖成环后新形成的一个不对称碳原子称为端基碳（anomeric carbon）。生成的一对差向异构体（anomer）有、二种构型。从Fischer式看（C1与C5的相对构型）：C1-OH与原C5（六碳糖）或C4（五碳糖）-OH，顺式为，反式为。从Haworth式看：C1-OH与C5（或C4）上取代基之间的关系：同侧为，异侧为。第14页/共39页单糖的结构基础知识糖的绝对构型（D、L） 绝对构型D-和L-的判断

12、是从醛基或者酮基开始最远的手性碳原子。 OCC H2O HO HHC H OC H OC H2O HC H OC H3C H3O - O H 甘 油 醛D 型D - 葡 萄 糖L - 鼠 李 糖 - D - 葡 萄 糖 - L - 鼠 李 糖Fischer式中最后第二个碳原子上-OH向右的为D型，向左的为L型。Haworth式中C5向上为D型，向下为L型。第15页/共39页单糖的结构基础知识 环的构象 OOO1234(2)(3)(4)(5) 呋喃糖五元环接近在同一平面上。唯醛糖的C3、酮糖的C4超出平面0.5A，几乎是固定的结构。 六元环有船式和椅式构象，在溶液或固体状态是都是椅式构象，不是C

13、1便是1C。C表示椅式（chair form）。OOC 1 式1 C 式1234512345 以C2、C3、C5、O四个原子构成的平面为准，C4处面上，C1处面下的标为4C1，简称C1，反之1C4简称1C。Angyal用总自由能来分析构象式的稳定性，比较二种构象式的总自由能差值，能量低的是优势构象。第16页/共39页核磁共振在多糖结构的应用1 1H NMRH NMR谱）谱）1 1H-H-1 1H H 2 2、TOCSY(TOCSY(全相关全相关) )谱谱 3 3、1 1H-H-1313C COSYC COSY谱（谱（HMQCHMQC） 4 4、远程、远程1 1H-H-1313C COSYC C

14、OSY谱（谱（HMBCHMBC） 5 5、NOESYNOESY谱谱 6 6、INADEQUATEINADEQUATE谱谱第17页/共39页核磁共振氢谱（1H NMR谱） 核磁共振氢谱（ 1H NMR），也称为质子磁共振谱（proton magnetic resonance，pmr），是发展最早，研究得最多，应用最为广泛的核磁共振波谱。在较长一段时间里核磁共振氢谱几乎是核磁共振谱的代名词。原因:一：质子的天然丰度接近 100%,核磁共振测定的绝对灵敏度是所有磁核中最大的。在 PFT NMR（脉冲傅立叶变换核磁共振谱仪）出现之前，天然丰度低的同位素，如13C等的测定很困难。二：1H是有机化合物中最

15、常见的同位素， 1H NMR 谱是有机物结构解析中最有用的核磁共振谱之一。 在多糖中的应用 可给出的信号有在4.3-5.9ppm的异头质子.可以判断异头碳的构型(5.00为-型, 5.00 为-型). 在1.1-1.3ppm处的6-位脱氧糖的甲基双峰. 在2.0-2.2ppm处的乙酰氨基的甲基峰. 在3.0-4.2ppm的非常小的区域中,结果严重重叠不能给出结构信息. 第18页/共39页碳核磁共振谱（1313C NMR C NMR 谱）1 BB谱(Proton broad band decoupling): 最常见的碳谱是宽带全去偶谱(BB)，又称质子噪声去耦谱，质子噪声去耦谱可以使碳谱简化，

16、它损失了13C 和1H 之间的耦合信息，每一种化学等价的碳原子只有一条谱线。碳谱的化学位移对核所受的化学环境是很敏感的，它的范围比氢谱宽得多，一般在 0-250ppm。对于分子量在 300-500 的化合物，碳谱几乎可以分辨每一个不同化学环境的碳原子，而氢谱有时却严重重迭。2 DEPT谱(Distortionless enhencement by polarization transfer): DEPT谱即无畸变极化转移增益法。可在质子去偶,又可在质子不去偶的条件下测定, 由于BB谱无法确定谱线所属的碳原子的级数，所以可以通过改变照射1H的第三脉冲宽度()，使作45，90 ，135 变化并测定

17、其13C NMR谱。 = 45时，CH1和CH2和CH3均为正号。 = 90时，只有CH1有正信号，而CH2和CH3信号均为0。 = 135时，只有CH1和 CH3有正信号，而CH2有负信号。 在多糖中的应用 确定异头碳的数目确定异头碳的数目: :异头碳的共振一般出现在90-112ppm. 确定构型确定构型 : :一般来说-型连接的C1化学位移比-型低1.5-3.0, -型的化学位移为97-101， -型103-105，来确定确定构型。 预言多糖的聚合程度预言多糖的聚合程度: : 一般还原末端的C-1出现在90-98ppm间,而取代碳水化合物的C-1(非还原单糖)出现在98-112ppm),因

18、而可预言多糖的聚合程度. 其他化学位移的信号: 52-57ppm间的共振信号一般为氨基取代碳的信号.170-176ppm范围的低场信号反映有己糖醛酸的羧基或乙酰基的存在.在60-70ppm间醛糖只有一个共振峰,而酮糖有两个.第19页/共39页-型-型异头氢区异头碳区-型-型第20页/共39页2 D H-H相关谱-H-H COSY COSY 谱本身为正方形，当 F1和 F2谱宽不等时则为矩形。正方形中有一条对角线（一般为左下右上）。对角线上的峰称为对角峰（ diagonal peak）。对角线外的峰称为交叉峰（ cross peaks）或相关峰（correlated peaks）。每个相关峰或交

19、叉峰反映两个峰组间的耦合关系。COSY 主要反映3J耦合关系。 它的解谱方法是：取任一交叉峰作为出发点，通过它作垂线，会与某对角线峰及上方的氢谱中的某峰组相交，它们即是构成此交叉峰的一个峰组。再通过该交叉峰作水平线，与另一对角线峰相交，再通过该对角线峰作垂线，又会与氢谱中的另一峰组相交，此即构成该交叉峰的另一峰组。第21页/共39页2 D H-H相关谱-H-H COSY第22页/共39页全相关谱 TOCSYTOCSY、 HOHAHAHOHAHA TOCSY（Total Correlation Spectroscopy）与 HOHAHA（Homonuclear Hartmann Hahn spe

20、ctscopy）称为总相关谱。可从某一个氢核的谱峰出发，找到与它处于同一耦合体系的所有氢核谱峰的相关峰。TOCSY 和 HOHAHA 的用途及谱图的外观是一样的，只是实验时所用的脉冲序列不同。TOCSY 和 HOHAHA 谱目前正被越来越广泛的使用。第23页/共39页第24页/共39页1H- 13C COSY谱（HMQC） HMQC 异核多重量子相干（Heteronuclear Multiple Quantum Coherence) C-H COSY 是13C 和1H 核之间的位移相关谱。它反映了13C 和1H核之间的关系。它又分为直接相关谱和远程相关谱，直接相关谱是把直接相连的13C 和1H

21、核关联起来，矩形的二维谱中间的峰称为交叉峰（ cross peak）或相关峰（correlated peak），反映了直接相连的13C 和1H核，在此图谱中季碳无相关峰。第25页/共39页第26页/共39页远程1H-13C COSY谱（HMBC）HMBCHMBC（1H 检测的异核多键相关实验，1H Detected Heteronuclear Multiple Bond Correlation或 Long Range Heteronuclear Multiple Quantum Coherecel）。远程相关谱则是将相隔两至四根化学键的13C 和1H 核关联起来，甚至能跨越季碳、杂原子等，交叉

22、峰或相关峰比直接相关谱中多得多，因而对于帮助推测和确定化合物的结构非常有用。 第27页/共39页NOESYNOESY谱谱 和和ROESYROESY谱谱 二维 NOE 谱简称为 NOESY，它反映了有机化合物结构中核与核之间空间距离的关系，而与二者间相距多少根化学键无关。因此对确定有机化合物结构、构型和构象以及生物大分子有着重要意义。 NOESY 的谱图与H-H COSY 非常相似，它的 F2维和 F1维上的投影均是氢谱，也有对角峰和交叉峰，图谱解析的方法也和 COSY 相同，唯一不同的是图中的交叉峰并非表示两个氢核之间有耦合关系，而是表示两个氢核之间的空间位置接近。 由于 NOESY 实验是由

23、 COSY 实验发展而来为的，因此在图谱中往往出现 COSY 峰，即 J偶合交叉峰，故在解析时需对照它的H-H COSY 谱将J 偶合交叉峰扣除，对多糖谱可以用此来判断多糖的构型。 当遇到中等大小的分子时（分子量约为 1000-3000），由于此时 NOE 的增益约为零，无法测到NOESY 谱中的相关峰（交叉峰），此时测定旋转坐标系中的 NOESY 则是一种理想的解决方法，这种方法称为 ROESY（ Rotating frame Overhause Effect Spectroscopy），由此测得的图谱称为 ROESY谱。ROESY 谱的解析方法与 NOESY 相似，同样 ROESY 谱中的

24、交叉峰并不全都表示空间相邻的关系，有一部分则是反映了耦合关系，因此在解谱时需注意。第28页/共39页突出表现NOE效应的NOESY谱CHOHOOCH3abcdCHOHOOCH3abcde第29页/共39页二维NMR7 7、INADEQUATEINADEQUATE谱 确定1313C- C- 1313C C的连接。可以根据已知确凿的信号开始，根据相互之间的偶合进行判断。第30页/共39页核磁共振谱图综合解析 识别氢谱与碳谱中的溶剂峰与杂质峰。 初步分析谱图，找出特征峰并确定各谱线的大致归属。 分析一维1H 谱，根据谱图中化学位移值、耦合常数值、峰形和峰面积找出一些特征峰，获得一些最明显的结论。 对

25、照13C 质子噪声去偶谱以及各个 DEPT 碳谱，确定各碳原子的级数。 按照化学位移分区的规律，大致确定各谱线所属的区域，如在饱和区还是在不饱和区，是否含杂原子、羰基以及活泼氢等。 借助二维核磁共振谱对图谱作进一步的指认。 解析H -H COSY 谱，从一维谱中已经确定的氢谱线出发找到与之相关的其它谱线。 解析13C -1H COSY（或 HMQC、HSQC）谱，同样从已知的氢谱线出发找到各相关的碳谱线，以此推断出这些碳谱线的归属。 解析13C -1H 远程相关谱（COLOC 或 HMBC），从已确定的碳谱线出发，找到与之相关的各氢谱线或从已知的氢谱线出发找到各相关的碳谱线，由此完成对一些未知

26、谱线的指认。在二维谱中由于一些相关峰的强度较弱，在实验中常常未被检测到，另外在图谱中还常常会出现假峰，这些在二维谱的解析中应特别注意。第31页/共39页第32页/共39页核磁共振的基本内容核磁共振的基本内容第33页/共39页核磁共振的基本概念核磁共振的基本概念1、是一种吸收光谱2、样品（溶液状态）置于强磁场中（1-12 Tesler)3、射频电子波（波长=110Mum）照射4、具有磁性原子核产生核能级跃迁而引起电子波的吸收核磁共振第34页/共39页测试NMR的溶剂 NMR溶剂的选择：不产生干扰信号、溶解性能好、沸点低、与被测样品不发生化学反应。N M R s o l v e n t s i g n a l s S o l v e n t