手把手教你做PCR引物的设计来自小木虫

1、PC咫I物设计的黄金法则1,引物最好在模板cDNA勺保守区内设计。DN年列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件(比如DNAman比对(Alignment),各基因相同的序列就是该基因的保守区。2,引物长度一般在1530碱基之间。引物长度(primerlength)常用的是18-27bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74C,不适于TaqDNA聚合酶进行反应。3,引物GC含量在40%60哝间，Tm值最好接近72C。GC含量(composition)过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC量不能相差太大。另外，上下游引物的

2、Tm值(meltingtemperature)是寡核甘酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核甘酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值510C。若按公式Tm=4(G+C+2(A+T»估计引物的Tma,则有效引物的Tm为5580C,其TM直最好接近72c以使复性条件最佳。4,引物3'端要避开密码子的第3位。如扩增编码区域，引物3'端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。5 .引物3'端不能选择A,最好选择To引物3'端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，

3、也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，GC错配的引发效率介于A、T之间，所以3'端最好选择To6 .碱基要随机分布。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3'端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发(Falsepriming)。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚喋吟或聚喀咤的存在。尤其3'端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在GCB集序列区错误引发。7 .引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构(Hairpin)使引物本身复性。这种二级结构会因空

4、间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3'端的互补重叠以防止引物二聚体(Dimer与Crossdimer)的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。8,引物5'端和中间G值应该相对较高，而3'端4G值较低。G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，G值越大，则双链越稳定。应当选用5'端和中间4G

5、值相对较高，而3'端4G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3'端的G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。（不同位置的G值可以用Oligo6软件进行分析）9 .引物的5'端可以修饰，而3'端不可修饰。引物的5'端决定着PCFT物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5'端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3将；引入蛋白质结合DNAff列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。3'端也不能有形成任何

6、二级结构可能。10 .扩增产物的单链不能形成二级结构。某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA勺稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（G。）小于58.61kJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2'-脱氧GTPM弋dGTP寸扩增的成功是有帮助的。11 .引物应具有特异性。引物设计完成以后，应对其进行BLAST佥测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。POSTbyBingsenXu前言：我是刚刚注册到丁香园，在

7、PCRK术讨论版看见置顶贴，“请求助引物设计的战友先进来这里！”稍微浏览了一下，发现很多朋友对PC咫I物设计还不是很熟悉，我愿意把自己积累的一点引物设计方面的经验和大家分享，希望不会做引物设计的朋友看完之后，可以不用再发求助贴而是自己动手做引物设计或者引物检验。开始之前：其实非常简单，不需要你下载任何软件，但是你得有一台电脑能上网。当然，最重要的是，你要很清楚用于做引物的模板序列，至于怎么找模板序列，不再本贴的讨论范围。另外，要先对PCR目的序列的长度有个大致估计，好了，马上开始吧：第一步：找到Primer3的站点。你不用记住这个站点，但是要记住“Primer3”这个词，然后打开GOOGLE页

8、，输入Primer3,跳出来的第一个项目就是了“Primer3Input0.4.0（primer3-web/htdocs/input-040.htm）”网址是/。第二步：贴上模板序列。进入Primer3站点，可以看到一个引物设计的界面。（附件Word文档里有图）在“Pastesourcesequencebelow（5'->3'-一.”下面的大空框里面把你的模板序列粘帖进去。注意是5'->3'方向的，数字或者空格都没关系，软件会自动过滤的。第三步：重要参数设定。首先是“ProductSizeRanges”，如

9、果你不希望软件给你随便做的话，首先要调整的就是这个参数。默认的参数实际上是从100至卜000,这个你得自己改，如果你希望产物的大小符合你的预期，尽可能把范围改小，比如480-500,具体看情况调整。第二个参数是“PrimerSize”，默认值一般可以用，但是，当你用熟了这个软件，你自己就知道该怎么改了。第三个参数是"PrimerTm”这个和PrimerSize差不多。第四步：Pickprimers:点一下这个按钮，符合你大小预期的primer就出来了，看看Primer3Output的界面，多么漂亮！你要的primer出来了，而且有primer在序列上的位置比对图，还有primer本身

10、的信息，包括位置，长度，TmG饶量，任何位置互补碱基数，3'端互补碱基数，以及引物序列，（注意，下游引物是5'->3'）,还有产物大小，两引物间任意互补碱基数，两引物间3'端互补碱基数等。如果引物尚在参数设定的范围内，但还不是最佳，将会给出警告。比如（随便举例，本人在做一个超长引物）：WARNING:Leftprimerisunacceptable:High3'stabilityOLIGOstartlentmgc%any3'seqLEFTPRIMER13369.0245.456.001.00TAATACGACTCACTATAGGGGTGAA

11、AGACTGCCRIGHTPRIMER13883467.8629.416.002.00AAAGGGTTAATTTGCATGCTTTATTTACACACATSEQUENCESIZE:1388INCLUDEDREGIONSIZE:1388PRODUCTSIZE:1388,PAIRANYCOMPL:5.00,PAIR3'COMPL:3.00第五步：引物设计检验：可以仅仅设计一向引物，只要在Pickleftprimer或者Pickrightprimer前面的勾勾掉一个就可以。也可以自己定义引物，放在Primer框里，（注意，下游引物的书写反向仍然是5'->3'）如果符合设

12、定的条件，软件将对给出引物评分，同时给出警告信息，根据警告信息可以适当对自定义引物做些调整即可，警告信息也让你做实验的时候心中有数。对于文献发表的引物，最好都要检查一下，这样就可以避免被别人有意无意误导。至于RT-PCRf用的引物，最好是使得产物跨过内含子，这样避免潜在DNA寸RT-PCR的干扰。实际做引物的时候，要把内含子都去掉，仅仅把外显子序列放入源序列框中，并且通过自定义引物设计的方法，使上下游引物分别全部或者部分落在不同外显子上。至于如何快速识别内含子和外显子以及电子PCR我将抽空另做说明。至于设计出来的引物的实际效果，根据我的经验，一般情况下都能做到PCFH次成功，也许随便那一段序列

13、做引物也能达到很好的效果，但是不管怎么说，软件做引物可以让自己心中有数。最后，GOODUCKTOEVERYONE.手把手教你在线做PCR引物设计POSTbyBingsenXu前言：我是刚刚注册到丁香园，在PC敬术讨论版看见置顶贴，“请求助引物设计的战友先进来这里！”稍微浏览了一下，发现很多朋友对PC咫I物设计还不是很熟悉，我愿意把自己积累的一点引物设计方面的经验和大家分享，希望不会做引物设计的朋友看完之后，可以不用再发求助贴而是自己动手做引物设计或者引物检验。开始之前：其实非常简单，不需要你下载任何软件，但是你得有一台电脑能上网。当然，最重要的是，你要很清楚用于做引物的模板序列，至于怎么找模板

14、序列，不再本贴的讨论范围。另外，要先对PCRS的序列的长度有个大致估计，好了，马上开始吧：第一步：找到Primer3的站点。你不用记住这个站点，但是要记住“Primer3”这个词，然后打开GOOGL苜页，输入Primer3,跳出来的第一个项目就是了“Primer3Input0.4.0(primer3-web/htdocs/input-040.htm)”网址是http:/。第二步：贴上模板序列。进入Primer3站点，可以看到一个引物设计的界面。（附件Word文档里有图）在“Pastesourcesequencebelow（5'->3'-i.

15、”下面的大空框里面把你的模板序列粘帖进去。注意是5'->3'方向的，数字或者空格都没关系，软件会自动过滤的。第三步：重要参数设定。首先是“ProductSizeRanged',如果你不希望软件给你随便做的话，首先要调整的就是这个参数。默认的参数实际上是从100到1000,这个你得自己改，如果你希望产物的大小符合你的预期，尽可能把范围改小，比如480-500,具体看情况调整。第二个参数是“PrimerSize”,默认值一般可以用，但是，当你用熟了这个软件，你自己就知道该怎么改了。第三个参数是"PrimerTm”这个和PrimerSize差不多。第四步：Pi

16、ckprimers:点一下这个按钮，符合你大小预期的primer就出来了，看看Primer3Output的界面，多么漂亮！你要的primer出来了，而且有primer在序列上的位置比对图，还要primer本身的信息，包括位置，长度，TmGC含量，任何位置互补碱基数，3'端互补碱基数，以及引物序列，（注意，下游引物是5'->3'）,还要产物大小，两引物间任意互补碱基数，两引物间3'端互补碱基数等。如果引物尚在参数设定的范围内，但还不是最佳，将会给出警告。比如（随便举例，本人在做一个超长引物）：WARNING:Leftprimerisunacceptable:

17、High3'stabilityOLIGOstartlentmgc%any3'seqLEFTPRIMER13369.0245.456.001.00TAATACGACTCACTATAGGGGTGAAAGACTGCCRIGHTPRIMER13883467.8629.416.002.00AAAGGGTTAATTTGCATGCTTTATTTACACACATSEQUENCESIZE:1388INCLUDEDREGIONSIZE:1388PRODUCTSIZE:1388,PAIRANYCOMPL:5.00,PAIR3'COMPL:3.00第五步：引物设计检验：可以仅仅设计一向引物，只

18、要在Pickleftprimer或者Pickrightprimer前面的勾勾掉一个就可以。也可以自己定义引物，放在Primer框里，（注意，下游引物的书写反向仍然是5'->3'）如果符合设定的条件，软件将对给出引物评分，同时给出警告信息，根据警告信息可以适当对自定义引物做些调整即可，警告信息也让你做实验的时候心中有数。对于文献发表的引物，最好都要检查一下，这样就可以避免被别人有意无意误导。至于RT-PCRf用的引物，最好是使得产物跨过内含子，这样避免潜在DNA寸RT-PCR勺干扰。实际做引物的时候，要把内含子都去掉，仅仅把外显子序列放入源序列框中，并且通过自定义引物设计的

19、方法，使上下游引物分别全部或者部分落在不同外显子上。至于如何快速识别内含子和外显子以及电子PCR我将抽空另做说明。至于设计出来的引物的实际效果，根据我的经验，一般情况下都能做到PCR-次成功，也许随便那一段序列做引物也能达到很好的效果，但是不管怎么说，软件做引物可以让自己心中有数。最后，GOODLUCKTOEVERYONE.Primri3InpulD.4.Qai*ili/hlidaminpiJl-l4O.hlml-UirrtiK4rInTmrF-ipInrarPrimerS(7.0.40)FickpnmenfromaDNAkspiHucEPngy凸口匕LfKrTa*24耳七rrunh/匕立卜二

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