第三章基因工程载体

1、第三章基因工程载体DNADNA： 1 1）独立的一个包括启动子（）独立的一个包括启动子（promoter)promoter)、编码区（、编码区（encoding encoding region)region)和终止子（和终止子（terminator)terminator)的基因，的基因，or or 组成基因的某个元件，组成基因的某个元件，一般是不可以进入受体细胞的；一般是不可以进入受体细胞的； 2 2）采用理化方法进入细胞后，也不容易在受体细胞内维持。所以，通）采用理化方法进入细胞后，也不容易在受体细胞内维持。所以，通过不同途径能将承载的外源过不同途径能将承载的外源DNADNA片段带入受体细胞

2、，并在其中得以维片段带入受体细胞，并在其中得以维持的持的DNADNA分子称为基因工程载体。分子称为基因工程载体。 载体 （Vectors）定义：在基因工程操作中，把能携带外源定义：在基因工程操作中，把能携带外源DNADNA进入受体细胞的进入受体细胞的DNADNA分子叫载体。分子叫载体。 载体 （Vectors）u运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞 u为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力 u为外源基因的扩增或表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 载体的功能载体的功能 目的基因能否有效转入受体细胞，并在其中维持高效表达，目的基因能

3、否有效转入受体细胞，并在其中维持高效表达，在很大程度上决定于载体在很大程度上决定于载体 。 （1 1）在宿主细胞内能独立复制，）在宿主细胞内能独立复制，oriori。 （3 3）多克隆位点：）多克隆位点：外源基因插入的单一限制酶位点。外源基因插入的单一限制酶位点。 基因工程对载体的要求基因工程对载体的要求（7 7）具有较好的安全性，不能任意转移。）具有较好的安全性，不能任意转移。 （2 2）有选择性标记）有选择性标记 Amp Ampr r、TetTetr r、KanKanr r等。等。（4 4）分子量小，）分子量小，可容纳较大的外源基因片段。可容纳较大的外源基因片段。（5 5）拷贝数多，方便外

4、源基因在细胞内大量扩增。拷贝数多，方便外源基因在细胞内大量扩增。（6 6）具有对受体细胞的可转移性。）具有对受体细胞的可转移性。大肠杆菌质粒载体大肠杆菌质粒载体 pBR322pBR322结构图结构图 复制起点复制起点 遗传标记基因遗传标记基因克隆位点克隆位点克隆位点克隆位点 载体载体 的种类的种类 按功能分类按功能分类 克隆载体克隆载体克隆一个基因或克隆一个基因或DNADNA片断片断 表达载体表达载体用于一个基因的蛋白表达用于一个基因的蛋白表达 整合载体整合载体把一个基因插入到染色体组中把一个基因插入到染色体组中 按来源分类按来源分类 质粒载体质粒载体 噬菌体载体噬菌体载体 柯斯质粒载体柯斯质

5、粒载体 人工染色体载体人工染色体载体 载体的种类和特征质粒质粒*受体细胞受体细胞结构结构插入片断插入片断举例举例 E.coli环状环状 8kbpUC18/19 , T-载体等载体等 噬菌体噬菌体E.coli线状线状9 - 24kb EMBL系列，系列， gt系列系列丝状噬菌体及噬菌粒丝状噬菌体及噬菌粒E.coli环状环状 10 kbM13mp系列系列粘粒载体粘粒载体E.coli环状环状35- 45kbpJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV BAC (Bacterial Artificial Chromosome)E.coli环状环状300 kb Pel oBAC

6、系列系列YAC (Yeast Artificial chromosome )酵母细胞酵母细胞线性染色体线性染色体 100 - 2000 kbMAC (Mammalian Artificial Chromosome)哺乳类细胞哺乳类细胞线性染色体线性染色体 1000 kb病毒载体病毒载体动物细胞动物细胞环状环状SV40 载体，昆虫载体，昆虫 杆状病毒载体杆状病毒载体穿梭载体穿梭载体动物细胞动物细胞 和细菌和细菌环状环状pSVK3质粒，质粒，PBV, Ti质粒质粒第一节第一节 克隆载体克隆载体1. 1. 质粒载体（质粒载体（plasimid vectorsplasimid vectors）2. 2

7、. 噬菌体载体（噬菌体载体（phage vectorsphage vectors）3. 3. 柯斯质粒载体（柯斯质粒载体（cosmid vectorscosmid vectors） 4. 4. 人工染色体载体（人工染色体载体（B/Y/HACB/Y/HAC） 质粒是质粒是一种广泛从在于细菌细胞中染色体以外的能自主的复制一种广泛从在于细菌细胞中染色体以外的能自主的复制的裸露的环状双链的裸露的环状双链DNADNA分分子，比病毒更简单。子，比病毒更简单。并不是寄主生长所必需的，但可以赋予寄主某些抵御外界环境因素不利影响的能力（带有抗性基因等） 。 质粒的生物学特性质粒的生物学特性（1）质粒的概念）质粒

8、的概念 差异很大，最小的只有差异很大，最小的只有1kb,1kb,只能编码中等大小的只能编码中等大小的2-32-3种种蛋白质分子，最大的达到蛋白质分子，最大的达到200kb200kb。 质粒的生存在寄主细胞中质粒的生存在寄主细胞中“友好友好”地地“借居借居”，它可以，它可以赋予寄主一些非染色体控制的遗传性状，以利于寄主的生赋予寄主一些非染色体控制的遗传性状，以利于寄主的生存。比如，对抗菌素的抗性，对重金属的抗性等。存。比如，对抗菌素的抗性，对重金属的抗性等。（2）质粒的大小）质粒的大小（3）质粒的生存）质粒的生存 质粒能利用寄主细胞的质粒能利用寄主细胞的DNADNA复制系统进行自主复制。质粒复制

9、系统进行自主复制。质粒DNADNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系。根据在每个上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系。根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒（严紧型复制控制的质粒（stringent plasmidstringent plasmid） ( (拷贝数少，拷贝数少，为为1-51-5个个) ) 松弛型复制控制的质粒（松弛型复制控制的质粒（relaxedrelaxed） ( (拷贝数多，可达拷贝数多，可达10-10-200200个拷贝个拷贝) ) （4）质粒的自主复制性）质粒

10、的自主复制性因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。 两个质粒在同一两个质粒在同一宿主中不能共存的现宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性。象称质粒的不相容性。具有不相容性的质粒具有不相容性的质粒组成的群体称为不相组成的群体称为不相容群，一般具有相同容群，一般具有相同的复制子。的复制子。 （5）质粒的不相容性）质粒的不相容性（6）质粒的可转移性）质粒的可转移性基因工程一般只能利用非接接合型质粒，保证分子操作过程中基因工程一般只能利用非接接合型质粒，保证分子操作过程中质粒在细胞中的稳定性。质粒在细胞中的稳定性。Tra protein from conjugative

11、 plasmidbom siteMob genemob mRNAMob proteinopen recipient cellhelper plasmid 即即mobmob基因的产物可打开非接合质粒的基因的产物可打开非接合质粒的bom bom 位点位点(oriT(oriT位点位点) )，借助，借助接合质粒接合质粒tratra基因的产物，使非接合质粒被动迁移到受体细胞中，这种基因的产物，使非接合质粒被动迁移到受体细胞中，这种现象称为迁移作用现象称为迁移作用(mobilization)(mobilization)。大肠杆菌接合（大肠杆菌接合（conjunctionconjunction）质粒质粒DN

12、ADNA的的tratra基因基因E.ColiE.Coli产生菌毛产生菌毛宿主与受体细胞结合宿主与受体细胞结合遗传物在细胞之间转移遗传物在细胞之间转移（指令）（指令）（迁移）（迁移）（7）携带特殊的遗传标记）携带特殊的遗传标记 野生型的质粒野生型的质粒DNADNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括： 物质抗性物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 物质合成物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱抗生素、细菌毒素、有机碱 这些

13、标记基因对这些标记基因对DNADNA重组分子的筛选具有重要意义重组分子的筛选具有重要意义 定义定义: :在基因工程中使用与选择重组体在基因工程中使用与选择重组体DNADNA转化细胞的转化细胞的基因基因 1. 1. 指示外源指示外源DNADNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞 2. 2. 指示外源指示外源DNADNA分子是否插入载体分子形成了重组子分子是否插入载体分子形成了重组子 遗传标记基因遗传标记基因标记基因的作用标记基因的作用1. 1. 抗性标记基因（可直接用于选择转化子）抗性标记基因（可直接用于选择转化子） a.a. 抗生素抗性基因抗生素抗性基

14、因: Ap: Apr r ，TcTcr r ，CmCmr r，KanKanr r，G418G418r r，HygHygr r ，NeoNeor r b. b. 重金属抗性基因重金属抗性基因: Cu: Cur r ，ZnZnr r ，CdCdr r c. c. 代谢抗性基因代谢抗性基因: TK: TK，抗除草剂基因，抗除草剂基因 2. 2. 营养标记基因（可直接用于选择转化子）营养标记基因（可直接用于选择转化子） 主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因，主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因， 这类基因在酵母转化中使用最频繁，如这类基因在酵母转化中使用最频繁，如T

15、RP1TRP1，URA3URA3，LEU2LEU2，HIS4HIS4等。等。 3. 3. 生化标记基因生化标记基因 其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZlacZ， GUSGUS，CAT CAT 4. 4. 噬菌斑噬菌斑标记基因的种类标记基因的种类 质粒的存在形式质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种。三种。双螺旋共价闭合环双螺旋共价闭合环（超螺旋）（超螺旋）开环双螺旋（一开环双螺旋（一个裂口）个裂口）线状双螺旋（两个线状双螺旋（两个裂口）裂口）（8）质粒的存在形式）质粒的存在形式质粒空间构型与电泳速

16、率质粒空间构型与电泳速率 同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：迁移率不同：scDNAscDNA最快、最快、l DNAl DNA次之、次之、ocDNAocDNA最慢。最慢。SCSCOCOCL L天然质粒的局限性天然质粒的局限性 天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。础进行人工构建。人工组建的质粒

17、人工组建的质粒 人工组建的质粒的第一个字母是质粒英文名字（人工组建的质粒的第一个字母是质粒英文名字（plasmidplasmid）的第）的第一个字符一个字符p p，用小写。，用小写。p p后有后有2 2个字母是大写，表示质粒的作者和个字母是大写，表示质粒的作者和实验室名称，再其后为质粒的编号。如实验室名称，再其后为质粒的编号。如pBR322pBR322，字母，字母p p代表质粒，代表质粒，BRBR是构建该质粒的研究人员的姓名，是构建该质粒的研究人员的姓名，322322代表代表构建的一系质粒的构建的一系质粒的编号。编号。 质粒载体的命名原则质粒载体的命名原则 第一阶段（第一阶段（19771977

18、年前）年前）天然质粒和重组质粒的利用，如天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, ColE1, pCR, pBR313pSC101, ColE1, pCR, pBR313和和pBR322pBR322。 第二阶段第二阶段增大载体容量（降低载体长度），建立增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUCpUC系列载体。系列载体。 第三阶段第三阶段完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如要求，如M13mpM13mp系列载体，含系列载体，含T3T3，T7T7，sp6sp6启动子载体，表启动子载体，

19、表达型载体及各种探针型载体。达型载体及各种探针型载体。质粒载体的发展概况质粒载体的发展概况 质粒载体的构建质粒载体的构建5 5. .根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件7 7、达到预期目的前提下，构建过程应力求简单、达到预期目的前提下，构建过程应力求简单质粒载体：质粒载体：作为基因工程载体，质粒至少应该具备复制的起始区、作为基因工程载体，质粒至少应该具备复制的起始区、选择标记基因区、多克隆位点等部分。选择标记基因区、多克隆位点等部分。 人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类： 高拷贝质粒高拷贝质粒

20、突变拷贝数控制基因突变拷贝数控制基因 拷贝数拷贝数1000-3000 1000-3000 扩增基因扩增基因 低拷贝质粒低拷贝质粒 来自来自pSC101 pSC101 拷贝数小于拷贝数小于10 10 表达某些毒性基因表达某些毒性基因 温敏质粒温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质 测序质粒测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker polylinker 整合质粒整合质粒 装有整合促进基因及位点装有整合促进基因及位点 便于外源基因的整合便于外源基因的整合 穿梭质粒穿梭质粒 装有针对两种不同受

21、体的复制子装有针对两种不同受体的复制子 便于基因克隆便于基因克隆 表达质粒表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件 探针质粒探针质粒 装有报告基因装有报告基因 便于启动子等元件的克隆筛选便于启动子等元件的克隆筛选 质粒载体的分类质粒载体的分类 （1 1）高拷贝数的质粒载体）高拷贝数的质粒载体ColE1ColE1、pMB1pMB1、pMB9pMB9 松弛型质粒。松弛型质粒。具有低分子量、高拷贝数的优点。具有低分子量、高拷贝数的优点。具有氯霉素扩增效应：每个细胞的拷贝数具有氯霉素扩增效应：每个细胞的拷贝数1000100030003000个！

22、个！用途：适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因用途：适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。产物。质粒载体的分类质粒载体的分类 （2 2）低拷贝数的质粒载体）低拷贝数的质粒载体由由pSC101pSC101派生来的载体。派生来的载体。特点是拷贝数低。特点是拷贝数低。pLG338pLG338、pLG339pLG339等等适合于克隆含量过高对寄主代谢有害的基因。适合于克隆含量过高对寄主代谢有害的基因。减少蛋白质产物对寄主细胞的毒害。减少蛋白质产物对寄主细胞的毒害。（3 3）温控的质粒载体）温控的质粒载体一些低拷贝基因是温度敏感型，如一些低拷贝基因是温度敏感型，如pBEU1pBEU1、p

23、BEU2pBEU2温度低（温度低（ 40 40 o oC C），拷贝数很快增加到），拷贝数很快增加到 10001000个。个。（4 4） 插入失活型质粒载体插入失活型质粒载体 载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。外源外源DNADNA片段插入会导致选择记号基因（如片段插入会导致选择记号基因（如tettetr r、ampampr r、cmcmr r等）失活。等）失活。如如pDF41pDF41、pDF42pDF42、pBR322pBR322。抗生素抗性抗生素抗性外源外源DNADNA无抗生素抗性无抗生素抗性（5 5）正选择的质粒载体正选择的质粒载

24、体 经典的大肠杆菌质粒载体经典的大肠杆菌质粒载体天然质粒，属严紧型低拷贝质粒。天然质粒，属严紧型低拷贝质粒。9.09 kb9.09 kb。四环素抗性。四环素抗性TetTetr r。ColE1ColE1天然质粒，属松弛型、高拷贝质粒，天然质粒，属松弛型、高拷贝质粒，6.66.6K Kb b。有氯霉素扩增效应，每个细胞有氯霉素扩增效应，每个细胞1000-30001000-3000拷贝拷贝选择标记选择标记大肠杆菌素（大肠杆菌素（colicincolicin）E1E1和对和对E1E1免疫的基因免疫的基因（immE1immE1）pcolicin E1能杀死不含能杀死不含ColE1 质粒的菌，质粒的菌，形

25、成噬菌斑。形成噬菌斑。 colicin E1colicin E1基因的结构基因的结构ceaimmkil结构基因结构基因免疫基因免疫基因溶菌基因溶菌基因 杀死不含有杀死不含有ColE1ColE1细菌的原因细菌的原因cea + kilcea + kil基因产物基因产物 不被其他细菌的不被其他细菌的colicin E1colicin E1所杀死的原因所杀死的原因immimm基因基因EcoR IEcoR I位于位于E1E1内部，插入外源内部，插入外源DNADNA导致导致E1E1失活，失活，使受体菌不能合成使受体菌不能合成E E（ColE1ColE1- -），但仍表现出对），但仍表现出对E1E1免疫型（

26、免疫型（ImmE1ImmE1+ +）。）。EcoR I 唯一的克隆位点Colicin E1外源外源DNADNA无无Colicinl用对外源用对外源colicin E1colicin E1的免疫性和自身不能合成的免疫性和自身不能合成colicin E1colicin E1作选择，操作非常繁杂。作选择，操作非常繁杂。pBR322pBR322：p:p:质粒；质粒；BRBR：质粒两位主要：质粒两位主要构建者姓氏的第一个字母；构建者姓氏的第一个字母；322322：实验编号：实验编号人工构建载体人工构建载体三个亲本质粒：三个亲本质粒：pMB1pMB1: :出发质粒出发质粒(ColE1)(ColE1)pSF

27、2124: AmppSF2124: Ampr rpSC101: TetpSC101: Tetr rpSF2124pMB1pSC101氨苄青霉素和四环素抗性氨苄青霉素和四环素抗性24个单一克隆位点。个单一克隆位点。9 9个导致个导致TetTetr r基因失活基因失活3 3个会导致个会导致AmpAmpr r基因失活基因失活pBR322pBR322的优点的优点 双抗生素抗性选择标记双抗生素抗性选择标记 抗生素抗性基因的插入失活效应是检测重组体抗生素抗性基因的插入失活效应是检测重组体质粒的有效方法，质粒的有效方法，分两次先后选择：分两次先后选择：没有获得载体的寄主细胞没有获得载体的寄主细胞 在在Amp

28、Amp或或TetTet中都死亡。中都死亡。获得重组载体的寄主细胞获得重组载体的寄主细胞 在在AmpAmp或或TetTet其中之一中死亡。其中之一中死亡。pBR322pBR322重组克隆的筛选重组克隆的筛选 重组克隆的重组克隆的 “插入失活插入失活”筛选方法筛选方法 pBR322pBR322插入在插入在TetTetr r中，基因型为中，基因型为TetTets s 、AmpAmpr r在含有在含有氨卞青霉素培养基上可生长，在含有四环素培养基上不生长；氨卞青霉素培养基上可生长，在含有四环素培养基上不生长； pBR322pBR322插入在插入在AmpAmpr r中，基因型为中，基因型为TetTetr

29、r 、AmpAmps s、在含有在含有氨卞青霉素培养基上不生长，在含有四环素培养基可生长；氨卞青霉素培养基上不生长，在含有四环素培养基可生长； 而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型。这种在一个基而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型。这种在一个基因位点中插入外源因位点中插入外源DNADNA片段，从而使该基因活性丧失的现象叫插入失活。片段，从而使该基因活性丧失的现象叫插入失活。 氯霉素扩增之后，每个细胞可氯霉素扩增之后，每个细胞可 10003000cop10003000copiesies 安全安全失去了转移蛋白基因失去了转移蛋白基因mobmob（mobilizationmobilizati

30、on）。不能通过接合转）。不能通过接合转移。移。 高拷贝数 分子小，克隆能力大分子小，克隆能力大长度长度4363bp4363bp，易于纯化，可以携带，易于纯化，可以携带6-8Kb6-8Kb的外源的外源DNADNA片段。片段。具有较多的单一酶切位点（具有较多的单一酶切位点（2424种）种）保留了转移蛋白（保留了转移蛋白（mobmob）的作用位点。）的作用位点。pBR322的缺点能够被能够被ColKColK质粒编码的质粒编码的mobmob蛋白识别，如果再蛋白识别，如果再有有F F质粒的参与，就有可能转移！质粒的参与，就有可能转移！ 删除删除mobmob识别位点识别位点（如质粒（如质粒pBR327p

31、BR327、pAT153pAT153等）。等）。pAT153pAT153：从从pBR322pBR322上切去上切去HaeIIHaeII片断，既除去了片断，既除去了mobmob识别位点，又增加质粒的拷贝数。识别位点，又增加质粒的拷贝数。PBR322的改进pBR325pBR325：在在pBR322pBR322位点上接入一段来自噬菌体位点上接入一段来自噬菌体PICmPICm的的HaeIIHaeII酶切片断（带有氯霉素抗性基酶切片断（带有氯霉素抗性基因因cmlcmlr r）。）。 cmlcmlr r上也带一个上也带一个EcoRIEcoRI位点。位点。使使EcoRI EcoRI 也成为插入失活型位点。也

32、成为插入失活型位点。 改造EcoR I 位点 pUC pUC系列载体系列载体 在在pBR322pBR322的基础上改造而成。属正选择载体。的基础上改造而成。属正选择载体。pUC7pUC7、pUC8pUC8、pUC9pUC9、pUC10pUC10、pUC11pUC11、pUC18pUC18、pUC19pUC19（1 1）元件来源）元件来源c. c. laczlacz基因：大肠杆菌基因：大肠杆菌laclac操纵子操纵子DNADNA区段，编码区段，编码-半乳半乳糖苷酶糖苷酶 - -肽链，是肽链，是LacZLacZ氨氨基端的一个片段基端的一个片段. .载体用于可编码半载体用于可编码半乳糖苷酶羧基端部分

33、序列的宿主细胞。乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。d. MCS d. MCS 多克隆位点。多克隆位点。a .oria .ori来自来自pBR322pBR322质粒的复制起点质粒的复制起点b. b. 标记基因（标记基因（amprampr）:pBR322:pBR322的的AmpAmpr r基因基因 （2 2）克隆位点）克隆位点 具有具有MCSMCS（多克隆位点）区段：位于（多克隆位点）区段：位于lacZlacZ基因的基因的55端。端。1010个连续的单一限制酶切位点，但它不破坏该基因功能。个连续的单一限制酶切位点，但它不破坏该基因功能。 IPTGIPTG：异丙基：异丙基-D-D-硫代半乳糖苷，乳糖

34、类似硫代半乳糖苷，乳糖类似物，又称为安慰诱导物，可代替乳糖诱导乳糖物，又称为安慰诱导物，可代替乳糖诱导乳糖操纵子结构基因的表达，即可诱导操纵子结构基因的表达，即可诱导laczlacz所编所编码的半乳糖苷酶氨基末端片段（码的半乳糖苷酶氨基末端片段（肽）的合肽）的合成。成。 x-gal x-gal：5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚吲哚-D-D-半乳糖苷，半乳糖苷，为生色底物，半乳糖苷酶为生色底物，半乳糖苷酶+ x-gal+ x-gal 蓝色蓝色-互补：互补：pUCpUC类载体带有类载体带有laczlacz基因，编码半乳糖苷酶基因，编码半乳糖苷酶氨基端片段（氨基端片段（-肽），此片段与宿主细

35、胞所编码的羧基端肽），此片段与宿主细胞所编码的羧基端半乳糖苷酶实现基因内互补，形成有功能的半乳糖苷酶，称半乳糖苷酶实现基因内互补，形成有功能的半乳糖苷酶，称-互补。互补。-肽，同时肽，同时诱导细菌产生半乳糖苷酶的羧基端片段。两种片段形成有诱导细菌产生半乳糖苷酶的羧基端片段。两种片段形成有功能的半乳糖苷酶，从而使功能的半乳糖苷酶，从而使x xgalgal水解，产生蓝色物质，水解，产生蓝色物质，使非重组菌落呈现蓝色。使非重组菌落呈现蓝色。-肽，肽，互补显色反应互补显色反应 PUCPUC载体的优点：载体的优点： a a 具有更小的相对分子质量和更高的拷贝数，具有更小的相对分子质量和更高的拷贝数，平均每个细胞可达平均每个细胞可达500-700500-700个拷贝个拷贝b b 具有具有MCSMCS片段，可把具有两种不同粘性末端片段，可把具有两种不同粘性末端的外源的外源DNADNA片段直接克隆到片段直接克隆到pUCpUC类载体上。类载体上。c c 可以用组织化学方法检测重组体（蓝白斑可以用组织化学方法检测重组体（蓝白斑筛选