基因表达调控第三课mRNA水平的研究9-29

1、 mRNA分析技术分析技术基因表达基因表达基因表达的变化可以两个水平进行分析：基因表达的变化可以两个水平进行分析：mRNA 水平水平 和蛋白质水平和蛋白质水平mRNA表达变化的检测方法：表达变化的检测方法：Northern blot, RT-PCR(半定量半定量PCR), Real-time PCR (定量定量PCR), 荧光原荧光原位杂交等、位杂交等、基因芯片、高通量测序基因芯片、高通量测序等等mRNA 表达变化的机制的研究方法方法有：表达变化的机制的研究方法方法有：启动子活性分启动子活性分析（转录水平分析）、析（转录水平分析）、mRNA转录效率分析（转录效率分析（Nuclear run o

2、n）、）、mRNA稳定性检测（转录后水平）稳定性检测（转录后水平）一、一、RNA研究策略和方法研究策略和方法RT-PCR, Real-time PCR，Northern blot, RNA酶保护实验酶保护实验, 差异筛选，差异筛选，基因芯片基因芯片Total RNA：rRNA约占80-85，tRNA和核内小分子RNA约占10%-15%，mRNA约占1%-5%，琼脂糖凝胶电泳中只能看到：28S，18S，5S。RNA提取注意事项：提取注意事项：要注意RNase的污染，因RNA极易被RNase的降解，操作时应尽量少说话，并在洁净的环境中操作，主要防止手、唾液和空气中RNase的污染；另一方面使用的所

3、有玻璃仪器、移液器、吸头和离心管都用0.5%DEPC溶液处理过夜,然后高压灭菌15分钟.但对于灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNase，可以不经处理直接用于提取RNA，实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有RNase污染，使用前必须180度干烤8小时或更长时间（玻璃器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品）提取用试剂：提取用试剂：Trizol reagent（一）（一）RNA的提取的提取RNA浓度和纯度检测浓度和纯度检测A260/A280 表示质量（一般在1.8-2.0），A260表示数量。RNA完整度检测完整度检测28S RNA大小一般为5 kb，18S RNA 大小一般为2 kb。28S RNA

4、的亮度一般是18S 的两倍。RNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳（二）（二）RT-PCR（半定量（半定量PCR）RT-PCR相关试剂相关试剂反转录引物反转录引物反转录引物反转录引物1防止防止RNA的降解，保持的降解，保持RNA的完整性。的完整性。2. 避免避免gDNA的污染，用的污染，用DNase处理。处理。3为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。4内参的设定：主要为了用于靶内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参的定量。常用的内参 有有GAPDH、-Actin等。其目的在于避免等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及定量误差、加样误差以及各

5、各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。5. 稀释稀释cDNA，内参循环数，内参循环数20-26。6. 扩增产物长度扩增产物长度300-500 bp。注意事项：注意事项：（三）（三）Real-time PCR 实时定量实时定量PCRu在在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。引

6、物设计原则引物设计原则在在NCBINCBI找到目的基因序列，以找到目的基因序列，以CDSCDS区进行引物设计。区进行引物设计。1.1.最好位于编码区最好位于编码区55端的端的300-400bp300-400bp区域内，可以用区域内，可以用DNAman,DNAman, Alignment Alignment 软件看看结果。软件看看结果。2.2.引物长度一般在引物长度一般在17-2517-25碱基之间碱基之间, ,上下游引物不能相差太大。上下游引物不能相差太大。3.G+C3.G+C含量在含量在40%-60%40%-60%之间，之间，45-5545-55最佳。最佳。4.4.引物自身不能有连续引物自身

7、不能有连续4 4个碱基的互补。个碱基的互补。5.5.引物之间不能有连续引物之间不能有连续4 4个碱基的互补。个碱基的互补。6.6.引物引物55端可以修饰。端可以修饰。7. 37. 3端不要以端不要以A A结尾，结尾，33端不可修饰，而且要避开端不可修饰，而且要避开AT,GC richAT,GC rich 的区域，避开的区域，避开T/C,A/GT/C,A/G连续结构（连续结构（2-32-3个）。个）。8. 8. 引物引物33端要避开密码子的第端要避开密码子的第3 3位。位。9.9. 荧光定量产物长度荧光定量产物长度80-150bp80-150bp最好，最长是最好，最长是300bp.300bp.1

8、0.10. 最好跨内含子。最好跨内含子。11.11.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于7070。12.TM12.TM值在值在55-6355-63度之间。度之间。uDNA 或或RNA 的绝对定量分析，包括病原微生物的绝对定量分析，包括病原微生物或病毒含量的检测，转基因动植物转基因拷贝数或病毒含量的检测，转基因动植物转基因拷贝数的检测，的检测，RNAi 基因失活率的检测等。基因失活率的检测等。u基因表达差异分析，例如比较基因表达差异分析，例如比较 经过不同处理样本经过不同处理样本之间特定基因的表达差异之间特定基因的表达差异 ( 如药物处理、物理处如药物处理

9、、物理处理、化学处理等理、化学处理等 ) ，特定基因在不同时相的表达，特定基因在不同时相的表达差异以及差异以及cDNA 芯片或差显结果的确证。芯片或差显结果的确证。u基因分型，例如基因分型，例如SNP检测，甲基化检测等。检测，甲基化检测等。Real-time PCR的应用：的应用：BAReal-time PCRRT PCR定量定量PCR引物设计软件：引物设计软件：Primer u将待检的将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同而按照同Southern blot相同的原理进行转膜和相同的原理进行转膜和用探针进行杂交

10、检测。用探针进行杂交检测。uNorthern blot主要用于检测样品中是否含有基主要用于检测样品中是否含有基因的转录产物（因的转录产物（mRNA）及其含量。）及其含量。（四）（四）Northern blotNorthern blot 流程图流程图Northern blot优点：优点：northern blot的灵敏度要好于基因芯片实验，而基因芯片优势在于的灵敏度要好于基因芯片实验，而基因芯片优势在于 它可在一次实验中同时反映出几千个基因表达量的变化；它可在一次实验中同时反映出几千个基因表达量的变化； 与定量与定量PCR的高灵敏度相比，的高灵敏度相比，northern blot较高的特异性可以

11、有效较高的特异性可以有效 的减少实验结果的假阳性。的减少实验结果的假阳性。缺点：缺点： Northern blot 实验中要防止实验中要防止RNA的降解，所有实验用品都需要经的降解，所有实验用品都需要经 过除去过除去RNA酶的过程，如高温烘烤、酶的过程，如高温烘烤、DEPC处理等。同时，处理等。同时， northern blot中很多实验用品如甲醛、中很多实验用品如甲醛、EB、DEPC、紫外灯等对人、紫外灯等对人 体都有一定的伤害。体都有一定的伤害。Northern blot 的优势在于它可检测目的片段的大小、是否具有可变剪切出现、可允许探针的部分不配对性，杂交过后的膜经过一定的处理除去探针后

12、还可保存很长时间再次杂交使用。（五）核糖核酸酶保护实验（五）核糖核酸酶保护实验（ribonuclease protection assay，RPA）是灵敏度和特异性很高的是灵敏度和特异性很高的mRNA定量分析方法定量分析方法 基本原理：基本原理： 将标记的特异将标记的特异RNA探针（探针（32P或生物素）与待测的或生物素）与待测的RNA样品液相杂交，标记的特异样品液相杂交，标记的特异RNA探针与目的探针与目的RNA结合，形成双链结合，形成双链RNA，免受，免受RNA酶的消化；酶的消化；而未结合的单链而未结合的单链RNA经经RNA酶酶A或或RNA酶酶T1消化消化形成寡核糖核酸。形成寡核糖核酸。R

13、PA基本程序：基本程序： 待测待测RNA的分离的分离 体外转录标记体外转录标记RNA探针探针 待测待测RNA与探针与探针RNA进行液相杂交进行液相杂交 RNA酶消化酶消化 不同大小杂交片段凝胶电泳分离不同大小杂交片段凝胶电泳分离核糖核酸酶保护实验原理示意图核糖核酸酶保护实验原理示意图32P标记的探针：杂交双链进行变性PAGE， 用放射自显影或磷屏成像系统检测探针的信号；生物素标记的探针：杂交双链经过变性PAGE后，电转移至尼龙膜，用链霉亲和素辣根过氧化物酶和化学发光底物与膜上biotin标记的探针结合，X射线胶片或化学发光图像分析仪检测杂交信号。RPA比比Northern Blot的优势：的优

14、势：1. 过量的探针与目的基因的杂交在液相环境完成，反应过量的探针与目的基因的杂交在液相环境完成，反应更加完全更加完全 2. RPA比比Northern Blot灵敏灵敏15-150倍倍，适合检测各种表，适合检测各种表达水平之基因达水平之基因 3. RPA通量高，通量高，同时检测多个基因同时检测多个基因，可评价他们在同一，可评价他们在同一情况下的差异表达情况下的差异表达 4. 一次一次RPA就能完成就能完成10 多次多次Northern Blot的工作，加的工作，加快研究速度快研究速度可对细胞或组织中原位表达的可对细胞或组织中原位表达的mRNA进行区域定位进行区域定位标记探针特异性地与目标靶标

15、记探针特异性地与目标靶mRNA序列杂交，检测标序列杂交，检测标记信号来确定基因在组织和细胞内表达的区位信息。记信号来确定基因在组织和细胞内表达的区位信息。可作为定量分析的补充。可作为定量分析的补充。（六）原位杂交（六）原位杂交（in situ hybridization，ISH）什么情况下选择原位杂交？什么情况下选择原位杂交？没有合适的抗体，不宜做没有合适的抗体，不宜做Western blot检测；样本量太少或比检测；样本量太少或比较复杂，不宜提取较复杂，不宜提取RNA或蛋白。或蛋白。原位杂交技术主要步骤：原位杂交技术主要步骤： 材料处理及细胞样品的固定；材料处理及细胞样品的固定； 样品的制备

16、和预处理；样品的制备和预处理； 探针的制备和预杂交；探针的制备和预杂交； 探针及样品的变性；探针及样品的变性； 杂交温育；杂交温育； 检测杂交信号，进行结果分析。检测杂交信号，进行结果分析。（七）差异表达基因筛选方法（七）差异表达基因筛选方法u 表达序列标签表达序列标签(expressed sequencing tag，EST) 技术，技术，1991u 差异显示差异显示RT-PCR(different display reverse transcription PCR，DDRT-PCR)，1992 u 抑制性差减杂交抑制性差减杂交(suppression subtractive hybridi

17、sation，SSH)，1996 u 基因芯片基因芯片(gene chip or micrOarray)u 基因表达的系列分析基因表达的系列分析(serial analysis of gene expression，SAGE)，1995 u 基于高通量测序的数字基因表达谱基于高通量测序的数字基因表达谱(DGE)分析分析转录抑制剂：转录抑制剂：actinomycin D (ActD), 放线菌素D5,6-dichloro-1D-ribofuranosyl-benzimidazole (DRB),-amanitin (-Am)（八）（八）mRNA稳定性分析稳定性分析荧光素酶报告基因分析系统荧光素酶

18、报告基因分析系统二、二、mRNA稳定性调节的机制稳定性调节的机制AU-rich elements (AREs) : AUUUA, 7-9% of cellular mRNAsThese elements are recognized by trans-acting factors, such as mRNA-binding proteins that bind directly or indirectly to the cis-acting elements and promote the deadenylation and degradation of the mRNA.AU-rich el

19、ement RNA-binding protein 1 (AUF1), tristetraprolin (TTP) ,KH-type splicing regulatory protein (KSRP)embryonic lethal abnormal vision (ELAV)-like protein 1 (HuR) and polyadenylate-binding protein-interacting protein 2 (PAIP2)（1）AU-rich sequences and mRNA binding proteins（2）Regulatory non-coding RNAm

20、iRNAs act by pairing to the mRNAs of protein-coding genes to direct their repression. lncRNAs show different mechanism of action, varying from chromatin remodeling, transcriptional responses and RNA processing.（3）Alternative polyadenylation (APA)APA consist of two steps, cleavage and polyadenylation of RNAs, which are maturation events that cut and add an oligo(dA) tail to the 3 end of the nascent transcript. This processing protects mRNAs from degradati