粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究

1、5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 1粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究能的初步研究导师： 钟 江 教授 研究生： 王立娟，992305研究方向： 分子病毒学生命科学学院 微生物学专业 2002年6月10日复旦大学硕士学位论文5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 2主要内容和时间安排l选题背景l实验材料和方法l实验结果与分析l总结与展望 预计时间：30分钟5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 3杆状病毒概述杆状病毒概述l杆状病毒： 双链DNA病毒

2、，有囊膜，感染昆虫l分类： 核型多角体病毒属（NPV) 颗粒体病毒属（GV)l形态与结构两种表型： 包涵体来源型病毒（ODV） 出芽型病毒（BV）。5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 4杆状病毒粒子的两种表型杆状病毒粒子的两种表型5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 5杆状病毒杆状病毒双相生活史双相生活史l第一时相： 时间：感染后的0-24小时结果：产生大量的BV，出芽释放，在虫体内传播l第二时相： 时间：感染24小时以后结果：形成大量的ODV，被多角体蛋白包裹，最终 形成多角体，经口感染其它宿主5/3/2022粉纹夜蛾颗粒

3、体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 6杆状病毒杆状病毒多角体多角体l电镜中看到的野生型电镜中看到的野生型AcMNPVAcMNPV的多角体的多角体5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 7多角体的形成多角体的形成l病毒感染的极晚期表达多角体蛋白l多角体蛋白占细胞中总蛋白的50%l依靠核定位信号序列运送到细胞核l多角体蛋白包裹ODV，形成多角体5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 8干扰多角体形成的因素干扰多角体形成的因素l多角体蛋白基因： AcMNPV多角体蛋白的3个Trp被Lys34, His36, 和Phe37替代多角

4、体能够结晶，但形态差异大，病毒粒子的包埋受影响 AcMNPV多角体蛋白第25位的Asp变为Gly仅产生一个不正常的大立方形的多角体，不包埋病毒粒子l25K基因： 该基因突变后多角体数量减少5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 9多角体的生物学功能作用多角体的生物学功能作用l保护病毒粒子l感染昆虫所必需5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 10选题背景杆状病毒的应用l杆状病毒的应用：a. 杆状病毒表达载体系统b. 杆状病毒生物杀虫剂5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 11杆状病毒表达载体系统的

5、优点l可以容纳大的插入片段（约10kbp）；l高效表达；l产物有毒性也可表达；l有外源DNA插入座位；l可以同时表达多个外源蛋白l可转译后加工修饰；l可在细胞系内表达，也可在昆虫活体内表达；l安全性好5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 12选题背景杆状病毒的应用l杆状病毒的应用：a. 杆状病毒表达载体系统b. 杆状病毒生物杀虫剂5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 13杆状病毒生物杀虫剂杆状病毒生物杀虫剂l优点： 安全有效， 不污染环境， 有后效。l缺点： 杀虫速度慢 杀虫谱狭窄5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构

6、与功能的初步研究 王立娟 14杆状病毒生物杀虫剂l构建重组杆状病毒杀虫剂的策略： a.表达昆虫激素 b.表达昆虫特异性毒素 c.删除内源性杆状病毒基因 d.应用增强蛋白来增强病毒的毒力5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 15增强蛋白（Enhancin）lEn-Tn编码901个氨基酸，分子量为104kul是一种金属蛋白酶：都具有金属蛋白酶的金属离子结合基序：HE（L/I）GH5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 16增强蛋白（Enhancin）l在Genebank中运行Blast检索工具得到19条明显具有同源性的序列，去掉重复

7、和非全长序列，共有13种不同的类似于增强蛋白的蛋白。5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 17杆状病毒增强蛋白间的进化关系（杆状病毒增强蛋白间的进化关系（ClustalClustal法）法）5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 18增强蛋白的增效机理增强蛋白的增效机理l昆虫的围食膜l增强蛋白作用机理： 降解围食膜蛋白粘蛋白IIM 提高围食膜的通透性 杆状病毒更容易进入昆虫体内5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 19利用增强蛋白提高利用增强蛋白提高AcMNPV感染力感染力l问题：表达增强蛋白的

8、重组杆状病毒杀虫剂不形成多角体或多角体稀少l对增强蛋白的结构和功能了解不够 增强蛋白与多角体形成的相互作用 增强蛋白的在细胞中的分布及机理5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 20项目来源和研究目的项目来源和研究目的l项目来源：国家自然科学基金（39870006）l研究目的： 进一步了解增强蛋白的结构和功能，更好的利用增强蛋白提高杆状病毒的杀虫效果。5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 21主要内容l选题背景l实验材料和方法l实验结果与分析l总结与展望5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 22

9、实验材料和方法实验材料：l草地夜蛾（Spodoptera frugiperda）卵巢组织细胞系SF21。l苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californica NPV，AcMNPV）1A分离株。l7种表达粉纹夜蛾颗粒体病毒（Trichoplusia ni Granulovirus，TnGV）增强蛋白基因不同片段的重组AcMNPV。5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 23实验材料重组病毒基因组所插入的增强蛋白基因片段l增强蛋白l2CTnlPolyVEFl#Kl#Bl#N/El3dkl3dsHis-Tag12706, 2706bp-11727

10、06, 2823bp12706, 2706bp4562706, 2250bp5712706, 2135bp7502706, 1956bp11976, 1976bp11669, 1669bp5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 24实验方法l细胞的培养与病毒的感染方法l杆状病毒的96孔板终点稀释法测定病毒效价l变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）l免疫印记实验（Western Blotting）l病毒感染后细胞的免疫荧光组织化学分析l多角体的纯化和免疫荧光组织化学分析l细胞核、质的分离和制样l细胞和多角体的记数5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构

11、与功能的初步研究 王立娟 25实验方法l细胞的培养方法： Sf-21细胞用TNM-FH培养液加10%小牛血清在27下恒温培养。一般每3天传一次代。每次传代比例为1：3到1：4。l病毒的感染方法： 细胞传代后24h感染病毒，保证M.O.I.5 感染复数（M.O.I.)=病毒效价病毒体积细胞密度细胞体积5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 26实验方法l细胞的免疫荧光组织化学分析细胞2%的甲醛PBS溶液固定0.25%的Triton X-100溶液通透PBS清洗5%山羊血清吸收加入一抗溶液1：5000.1%的NP40-PBS溶液清洗加入FITC标记的二抗溶液1：20

12、00清洗观察5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 27实验方法l细胞核、质的分离细胞液3000 r/min离心，弃上清冰浴的PBS溶液清洗，离心弃上清TM-2缓冲液重悬细胞0.5%Triton X-100冰浴5mins4.5号的针头将此细胞液通过3遍800 r/min离心10mins，沉淀细胞核,上清为去核液5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 28实验方法l多角体的纯化和预制收集细胞，清洗，离心2NP40-0.2% SDS悬浮细胞，震荡，破碎细胞离心，沉淀蔗糖梯度密度超速离心，收集多角体带玻璃研磨器中研磨多角体加0.1M N

13、a2CO3-0.05M NaCl，迅速加酸中和，使多角体松散免疫荧光组织化学方法处理5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 29主要内容l选题背景l实验材料和方法l实验结果与分析l总结与展望5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 30实验结果与分析l结果一：结果一：7 7种表达不同增强蛋白片段的种表达不同增强蛋白片段的重组病毒与野生型重组病毒与野生型AcMNPVAcMNPV病毒混合感染病毒混合感染的分析的分析5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 31结果一：表达增强蛋白的重组病毒与野生型病毒结果一

14、：表达增强蛋白的重组病毒与野生型病毒混合感染的分析混合感染的分析表表1. 71. 7种重组杆状病毒与野生型种重组杆状病毒与野生型AcMNPVAcMNPV的病毒效价的病毒效价病毒名称病毒名称 病毒效价（病毒效价（ TCIDTCID5050/ /mlml） 野生型野生型 A AcMNPVcMNPV 3.403.4010107 7 2CTn2CTn 2.302.3010107 7 POLYvefPOLYvef 3.263.2610107 7 #B#B 1.981.9810107 7 #K#K 1.861.8610107 7 #N/E#N/E 2.062.0610107 7 3dk3dk 2.122.

15、1210107 7 3ds3ds 1.761.7610107 7 5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 32结果一：表达增强蛋白的重组病毒与野生型病毒结果一：表达增强蛋白的重组病毒与野生型病毒混合感染的分析混合感染的分析7 7种重组病毒所表达的增强蛋白全长或片段的检测种重组病毒所表达的增强蛋白全长或片段的检测1.蛋白蛋白Marker, 2.POLYvef, 3.#K, 4.2CTn, 5.3ds, 6.3dk, 7.#N/E, 8.#BSDS-PAGE抗增强蛋抗增强蛋白抗体免白抗体免疫印迹检疫印迹检测测5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步

16、研究 王立娟 33结果一：表达增强蛋白的重组病毒与野生型病毒结果一：表达增强蛋白的重组病毒与野生型病毒混合感染的分析混合感染的分析重组病毒重组病毒3ds3ds增强蛋白表达的增强蛋白表达的SDS-PAGESDS-PAGE和和WesternWestern检测。检测。各蛋白条带如下：1: 分子量标准（ku）, 2: SDS-PAGE. 3: Western.5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 34结果一：表达增强蛋白的重组病毒与野生型病毒结果一：表达增强蛋白的重组病毒与野生型病毒混合感染的分析混合感染的分析未感染的未感染的SF21SF21细胞和被野生型细胞和被野生

17、型AcMNPVAcMNPV感染的感染的SF21SF21细胞细胞5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 35结果一：表达增强蛋白的重组病毒与野生型病毒结果一：表达增强蛋白的重组病毒与野生型病毒混合感染的分析混合感染的分析7 7种重组杆状病毒与野生型种重组杆状病毒与野生型AcMNPVAcMNPV单独或混合感染的单独或混合感染的SF21SF21细胞细胞5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 36表2. 7种重组病毒分别与野生型AcMNPV混合感染SF21细胞时产生的多角体数比较野生型AcMNPV 2.64107 100.00%2CTnA

18、cMNPV 1.14107 43.18%POLYvefAcMNPV 6.80106 25.76%#KAcMNPV 2.08107 78.79%#BAcMNPV 1.96107 74.24%#N/EAcMNPV 2.12107 80.30%3dkAcMNPV 1.96107 74.24%3dsAcMNPV 2.26107 85.61%与野生型与野生型AcMNPVAcMNPV混合感染的重组病毒混合感染的重组病毒 产生的多角体数（个产生的多角体数（个/ml/ml） 相对产量相对产量5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 37结果一：表达增强蛋白的重组病毒与野生型病毒结

19、果一：表达增强蛋白的重组病毒与野生型病毒混合感染的分析混合感染的分析相对干扰能力= =设重组病毒POLYvef的干扰多角体形成的能力为1， 计算重组病毒对野生型AcMNPV形成多角体的相对干扰能力：100%该病毒 + wtAcMNPV 多角体产量POLYvef+ wtAcMNPV 多角体产量1X5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 38结果一：表达增强蛋白的重组病毒与野生型病毒结果一：表达增强蛋白的重组病毒与野生型病毒混合感染的分析混合感染的分析0%20%40%60%80%100%120%POLY vef2CTn#K#B#N/E3dk3ds重组病毒名称干扰能力

20、: 百分比图4. 7种重组病毒对野生型AcMNPV形成多角体的干扰能力的比较5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 39结果一：表达增强蛋白的重组病毒与野生型病毒结果一：表达增强蛋白的重组病毒与野生型病毒混合感染的分析混合感染的分析结论：l表达增强蛋白全长或部分片段的重组杆状病毒对AcMNPV多角体形成有不同程度的干扰l表达全长增强蛋白的重组病毒POLYvef的干扰能力最强l表达长的增强蛋白片段的重组病毒的干扰能力大于表达短的增强蛋白片段的重组病毒5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 40实验结果与分析l结果二：增强蛋白与多角体

21、共包埋结果二：增强蛋白与多角体共包埋5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 41结果二：增强蛋白与多角体共包埋结果二：增强蛋白与多角体共包埋BA重组病毒重组病毒2CTn2CTn和和AcMNPVAcMNPV单独及混合感染单独及混合感染SF21SF21细胞的蛋白分析细胞的蛋白分析M M：分子量标准（ku）； 1 1：2CTn和AcMNPV混合感染细胞2 2：2CTn感染细胞；3 3：AcMNPV单独感染细胞；4 4：未感染细胞SDS-PAGE抗增强蛋白抗体免疫印迹分析抗增强蛋白抗体免疫印迹分析增强蛋白增强蛋白5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步

22、研究 王立娟 42结果二：增强蛋白与多角体共包埋结果二：增强蛋白与多角体共包埋抗增强蛋白抗体荧光抗增强蛋白抗体荧光免疫组织化学法免疫组织化学法检测病毒检测病毒感染的感染的SF21SF21细胞细胞A、B：2CTn和AcMNPV混合感染的细胞C、D：AcMNPV单独感染的细胞A A与与B B，C C与与D D均分别均分别为同一视野，各在可见光（为同一视野，各在可见光（A，C）和荧光（）和荧光（B，D）显微镜下观察。）显微镜下观察。5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 43结果二：增强蛋白与多角体共包埋结果二：增强蛋白与多角体共包埋病毒病毒多角体的蛋白电泳与免疫印迹

23、分析多角体的蛋白电泳与免疫印迹分析M：分子量标准（ku）1：AcMNPV单独感染的多角体。 2：2CTn和AcMNPV混合感染的多角体；箭头所指为增强蛋白。SDS-PAGE抗增强蛋白抗体免疫印迹分析抗增强蛋白抗体免疫印迹分析5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 44结果二：增强蛋白与多角体共包埋结果二：增强蛋白与多角体共包埋抗增强蛋白抗体荧光抗增强蛋白抗体荧光免疫组织化学法免疫组织化学法检测病毒多角体检测病毒多角体A：AcMNPV单独感染的多角体, 一抗为抗增强蛋白抗体；B：2CTn和AcMNPV混合感染的多角体,一抗为抗增强蛋白抗体; C：2CTn和AcMN

24、PV混合感染的多角体,一抗为抗多角体蛋白抗体.ABC每对图像均分别每对图像均分别为同一视野，各在可见光（上）和荧光（下）显微镜下观察。为同一视野，各在可见光（上）和荧光（下）显微镜下观察。5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 45结果二：增强蛋白与多角体共包埋结果二：增强蛋白与多角体共包埋结论l混合感染细胞中增强蛋白可与多角体蛋白共同表达l增强蛋白与多角体蛋白的共同表达可以发生在同一个细胞中l混合感染产生的病毒多角体中带有增强蛋白5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 46实验结果与分析l结果三：与增强蛋白进入细胞核有结果三：与

25、增强蛋白进入细胞核有关的区域的初步分析关的区域的初步分析5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 47结果三：与增强蛋白进入细胞核有关的区域的初结果三：与增强蛋白进入细胞核有关的区域的初步分析步分析抗增强蛋白抗体抗增强蛋白抗体荧光免疫荧光免疫组织化学法检测组织化学法检测7 7种表达增种表达增强蛋白不同片段的重组杆强蛋白不同片段的重组杆状病毒感染的细胞中增强状病毒感染的细胞中增强蛋白的定位蛋白的定位每对每对图像均分别图像均分别为同一视野，各为同一视野，各在可见光（左）和荧光（右）显在可见光（左）和荧光（右）显微镜下观察。微镜下观察。5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒

26、增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 48结果三：与增强蛋白进入细胞核有关的区域的初结果三：与增强蛋白进入细胞核有关的区域的初步分析步分析7 7种含有增强蛋白不同片段的重组病毒感染的细胞种含有增强蛋白不同片段的重组病毒感染的细胞细胞质与细胞核的细胞质与细胞核的SDS-PAGESDS-PAGE和和westernwestern检测结果检测结果 1:SF21去核液2:#B感染细胞核；3:#B感染细胞去核液；4:#K感染细胞去核液；5:#K感染细胞核；6:POLYvef感染细胞核7:POLYvef感染细胞去核液8:2CTn感染细胞核; 9:2CTn感染细胞去核液;SDS-PAGEWestern-Blot5/3/2022粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究 王立娟 49结果三：与增强蛋白进入细胞核有关的区域的初结果三：与增强蛋白进入细胞核有关的区域的初步分析步分析7 7种含有增强蛋白不同片段的重组病毒感染的细胞细种含有增强蛋白不同片段的重组病毒感染的细胞细胞质与细胞核的胞质与细胞核的SDS-PAGESDS-PAGE和和westernwestern检测结果（续）检测结果（续） 1: #N/E感染细胞