制备液相色谱技术(LC-MS)

1、高效高效制备液相色谱技术制备液相色谱技术高效高效制备液相制备液相色谱色谱的原理：的原理： 色谱分离原理无论是分析型色谱还是制备型色谱都是相同的，色谱分离原理无论是分析型色谱还是制备型色谱都是相同的，那就是那就是。 但是在理论的遵循上，制备型有时需打折扣。但是在理论的遵循上，制备型有时需打折扣。 这是由于两种类型的色谱最终的目的是不同的。这是由于两种类型的色谱最终的目的是不同的。分析型色谱：分离度高，灵敏度高分析型色谱：分离度高，灵敏度高，以含量测定为目的，以含量测定为目的。制备型色谱：制备型色谱：要求要求纯度、产量纯度、产量和和收益。收益。 经典的制备经典的制备色谱色谱方法与方法与高效高效制备

2、液相制备液相色谱色谱的异同的异同及优缺点：及优缺点：相同：目的相同；某些方法原理也相同。相同：目的相同；某些方法原理也相同。不同：自动化程度不同，效率不同，分离复杂化不同：自动化程度不同，效率不同，分离复杂化合物的能力不同。合物的能力不同。经典制备经典制备色谱色谱方法：柱方法：柱色谱、色谱、薄层薄层色色谱谱 高效高效制备液相制备液相色谱色谱优点：效率高，收率相对较高，特别适合复杂样品、优点：效率高，收率相对较高，特别适合复杂样品、性质接近化合物的纯化。纯化效果理想。性质接近化合物的纯化。纯化效果理想。缺点：设备复杂昂贵，投资大，运行费用较高。缺点：设备复杂昂贵，投资大，运行费用较高。经典制备经

3、典制备色谱色谱方法方法优点：优点： 设备简单，投资小，见效快。能满足一般样设备简单，投资小，见效快。能满足一般样品的品的 纯化要求。纯化要求。缺点：缺点： 效率低下，收率低，对于过于复杂的化合物，效率低下，收率低，对于过于复杂的化合物，纯化效果不理想。纯化效果不理想。 制备液相色谱又称纯化系统，是目前高效制备液相色谱又称纯化系统，是目前高效率制备纯化合物最有力的方法，广泛应用于：率制备纯化合物最有力的方法，广泛应用于： 1.天然产物的分离与纯化天然产物的分离与纯化 2.合成药物的纯化合成药物的纯化 3.合成合成反应反应中间产物或中间产物或副产物的制备副产物的制备 4.手性药物的分离与纯化手性药

4、物的分离与纯化 5.药物杂质的分离药物杂质的分离制备制备 . . . . . .重复性重复性选择性要求选择性要求色谱柱吸附等温线色谱柱吸附等温线正常载荷正常载荷(loading)：色谱柱吸附等温线色谱柱吸附等温线超载超载(overloading)：纯度（纯度（purity)、产量（、产量（throughput）和收益（和收益（yield）（）（PTY）三者的关系）三者的关系浓度过载和体积过载浓度过载和体积过载浓度过载和体积过载色谱示意图浓度过载和体积过载色谱示意图什么时候使用浓度过载什么时候使用浓度过载?什么时候使用体积过载什么时候使用体积过载? 一 般 情 况 下 ， 由 于 需 要 有 较

5、 大 的一 般 情 况 下 ， 由 于 需 要 有 较 大 的throughput，所以浓度过载使用较多，但当，所以浓度过载使用较多，但当样品浓度过稀，又没有合适的方法浓缩时样品浓度过稀，又没有合适的方法浓缩时或或流动相溶解样品的能力较弱时，流动相溶解样品的能力较弱时，这时就应当这时就应当使用体积过载。使用体积过载。由分析型由分析型色谱如何色谱如何扩展到制备型扩展到制备型色谱？色谱？扩展计扩展计算算扩展计算扩展计算扩展计算举例扩展计算举例r1=1.5mm, r2=10.6mm, V1=0.6mL/min V2=? 计算结果：计算结果：30mL/min=30ml/min扩展计算举例扩展计算举例?

6、计算结果计算结果25mg0.35mL/min流速下的色谱图流速下的色谱图（分析型）（分析型）经经扩展扩展计算，采用不同的柱径、进样量和流速样品的色谱图计算，采用不同的柱径、进样量和流速样品的色谱图上述五种色谱状态的参数：上述五种色谱状态的参数：在分析型色谱柱上，不同进样量的色谱图在分析型色谱柱上，不同进样量的色谱图在制备型色谱柱上的色谱图在制备型色谱柱上的色谱图制备液相馏分收集的三种方式制备液相馏分收集的三种方式1. 基于时间（基于时间（Time-based）2. 基于峰（基于峰（peak-based）3. 基于质量（基于质量（Mass-based）基于时间（基于时间（Time-based）

7、根据馏分的保留时间及其色谱峰宽，根据馏分的保留时间及其色谱峰宽，以时间作为馏分收集器动作的指令参数。以时间作为馏分收集器动作的指令参数。特点：特点： 参数设置方便，样品收益高、损失少。参数设置方便，样品收益高、损失少。 色谱保留时间的不稳定会影响到馏分色谱保留时间的不稳定会影响到馏分的纯度和收益。的纯度和收益。Time-based用峰的时间分割，按峰收集馏分用峰的时间分割，按峰收集馏分 色谱峰重叠严重，重叠面积很大，收集到的色谱峰重叠严重，重叠面积很大，收集到的两个馏分将明显不纯。这时应考虑使用两个馏分将明显不纯。这时应考虑使用Time-based。Time-based基于峰（基于峰（Peak

8、-based） 根据色谱峰的正负斜率，触发馏分收集器，根据色谱峰的正负斜率，触发馏分收集器，以色谱峰正负斜率作为馏分收集器动作的指令以色谱峰正负斜率作为馏分收集器动作的指令参数。参数。特点：特点： 馏分纯度高。馏分纯度高。 馏分保留时间的不稳定不会影响到馏分的馏分保留时间的不稳定不会影响到馏分的纯度。纯度。 参数设置不方便（斜率参数需计算）；受参数设置不方便（斜率参数需计算）；受色谱峰峰形改变的影响较大。色谱峰峰形改变的影响较大。 样品收益低。样品收益低。 利用正、负斜率按峰进行馏分收集。利用正、负斜率按峰进行馏分收集。Peak-based 设置阈值的目的是为了消除噪声的影响。设置阈值的目的是

9、为了消除噪声的影响。Peak-basedPeak-based实例实例（只收集后面这一组分）（只收集后面这一组分）基于质量（基于质量（Mass-based） 根据馏分的质量作为指令参数，触发馏根据馏分的质量作为指令参数，触发馏分收集器。分收集器。特点：特点： 馏分纯度高、且收益高；馏分纯度高、且收益高； 馏分保留时间以及色谱峰峰形改变都不会馏分保留时间以及色谱峰峰形改变都不会影响到馏分的纯度；影响到馏分的纯度； 参数设置方便；参数设置方便； 需配备需配备MS检测器，设备检测器，设备费用费用投入较大。投入较大。Mass-based 当使用按质量进行馏分收集时，只有当当使用按质量进行馏分收集时，只有

10、当MSD检测到色谱峰含有目标质量数，且该目检测到色谱峰含有目标质量数，且该目标质量数的强度超出特定的阈值时，馏分收标质量数的强度超出特定的阈值时，馏分收集才被触发。这就确保了在每次进样中只收集才被触发。这就确保了在每次进样中只收集含目标化合物的馏分。大部分情况下只有集含目标化合物的馏分。大部分情况下只有一个馏分。一个馏分。 不足之处是注入的不足之处是注入的其他其他样品组分不能回样品组分不能回收。收。按质量数进行馏分收集的结果按质量数进行馏分收集的结果三种馏分收集方式的比较三种馏分收集方式的比较它们与纯度、产量和收益（它们与纯度、产量和收益（PTY）的关）的关系怎样？系怎样？结合实际需求合理选择

11、结合实际需求合理选择。三种馏分收集方式如何选择？三种馏分收集方式如何选择？高效高效制备液相制备液相色谱色谱流路示意图流路示意图1、延迟体积校正、延迟体积校正2、扩散影响、扩散影响两个问题：两个问题：什么是延迟体积？什么是延迟体积？ 理想情况下，当检测器检测到组分信号理想情况下，当检测器检测到组分信号时，同一时刻，组分也被馏分收集器收集到。时，同一时刻，组分也被馏分收集器收集到。 实际情况下，这是做不到的，因为存在实际情况下，这是做不到的，因为存在一个延迟体积。一个延迟体积。 延迟体积：检测池到馏分收集器之间管延迟体积：检测池到馏分收集器之间管路的体积。路的体积。高效高效制备液相制备液相色谱色谱

12、流路示意图流路示意图延迟体积校正延迟体积校正 后运行时间：是指分析物组分从检测池到后运行时间：是指分析物组分从检测池到馏分收集器所用的时间。馏分收集器所用的时间。 为了准确地触发馏分收集器的启动和停止，为了准确地触发馏分收集器的启动和停止，必须测定后运行时间。后运行时间可以转换成必须测定后运行时间。后运行时间可以转换成与流速无关的延迟体积。与流速无关的延迟体积。 后运行时间测定方法之一：后运行时间测定方法之一： 通过在流路内注射一种染料，当馏分收集通过在流路内注射一种染料，当馏分收集器针尖出现该染料时记录时间。器针尖出现该染料时记录时间。 后运行时间后运行时间t馏分收集器馏分收集器- t检测器

13、检测器 后运行时间测定方法之二：后运行时间测定方法之二： 在馏分收集器内装入一个检测器，该检在馏分收集器内装入一个检测器，该检测器称为延迟传感器。将延迟校正物注入流测器称为延迟传感器。将延迟校正物注入流路，两个检测器都记录信号。两个检测器之路，两个检测器都记录信号。两个检测器之间的时间差就是后运行时间。间的时间差就是后运行时间。 根据校正时所用的流速，系统将自动计根据校正时所用的流速，系统将自动计算出准确的延迟体积，并保存，同时也能计算出准确的延迟体积，并保存，同时也能计算出每个流速下的后运行时间，当流速改变算出每个流速下的后运行时间，当流速改变时，不需要再校正后运行时间。时，不需要再校正后运行时间。扩散扩散 扩散使峰（谱带）变宽扩散使峰（谱带）变宽 ，严重削弱了，严重削弱了色谱的分辨（分离）能力